胰腺癌细胞中PRSS3激活的分子机制

复发与转移是导致胰腺癌预后差的主要原因。我们最近发现，三型胰酶原PRSS3在人胰腺癌细胞中高表达可以通过PAR1介导的ERK通路，促进肿瘤细胞浸润和转移；抑制ERK激活可以延缓转移的进程，但不能根治该肿瘤。PRSS3激活PAR1后还可能通过其它传导通路促进胰腺癌进展。鉴于PRSS3所具有的重要生理功能，通过关闭该基因表达或应用该酶的抑制剂来治疗胰腺癌的可行性甚小。因此，如果能够阐明PRSS3这个酶原是如何在胰腺癌细胞中被异位激活的，将为胰腺癌的治疗提供一个根本的有效途径。我们的初步研究结果提示，PRSS3很可能被Cathepsin B异位激活。本课题拟通过一系列体内、外功能性试验来阐明PRSS3在肿瘤细胞中激活的分子机制及其对胰腺癌细胞增生、发展和转移的影响,并对采用体内靶向抑制PRSS3的激活来治疗胰腺癌进行探讨。本研究结果将为阐明胰腺癌恶性进展的原因和研制新的治疗方法提供新的理论依据。

胰腺癌恶性度高，预后差，复发与转移是其主要原因。我们前期研究证实，PRSS3在人胰腺癌细胞中通过PAR1介导ERK磷酸化上调VEGF表达，从而促进肿瘤细胞浸润和转移，抑制ERK信号传导通路可以延缓转移的进程，该研究结果2010年已在“GUT”发表。本课题拟探讨胰腺癌细胞中激活PRSS3的上游信号，从功能上研究PRSS3在肿瘤细胞中激活的分子机制及其对胰腺癌细胞增生、发展和转移的影响。. 我们用Western Blotting的方法检测发现，Cathepsin B和PRSS3在PaTu8988s中均高表达。原本课题设计通过siRNA技术关闭该细胞Cathepsin B的表达，检测PRSS3的活性的变化，从而观察Cathepsin B对PRSS3活性的影响。但是考虑到Cathepsin B是作为酶来对PRSS3发挥作用，仅仅利用siRNA干扰Cathepsin B可能较难使Cathepsin B对PRSS3的激活作用产生显著影响。随着基因编辑技术的发展，我们利用最新的基因组编辑技术ZFN，设计并构建了针对人的Cathepsin B前端外显子编码框的两对ZFN。然后，我们用T7核酸内切酶检测ZFN的敲除效率，发现这两对ZFN对人的Cathepsin B不能实现有效的敲除。. 随之出现了更新的基因组编辑技术Talen，而且多篇研究报告显示了Talen设计简单易行，而且成功率高，因此，随后我们采用Daniel Voytas的Talen Kit，针对人的Cathepsin B设计并构建了多对Talen。我们参考Jin-Soo Kim的方法，构建了Talen剪切效率验证报告基因。与多对Talen分别共转后，选择剪切效率最高的一对Talen，经由流式细胞仪筛选，高效快速的获得CathepsinB特异性敲除的细胞系。接下来我们检测敲除CathepsinB后PaTu8988s细胞中PRSS3的表达和活性，但是结果显示敲除CathepsinB并不影响PRSS3的表达，与我们预期的结果并不一致。. 鉴于与预期不同的结果，我们暂时把精力转向本课题组另外一个关于改造溶肿瘤病毒用于胰腺癌生物治疗的课题上，承担了部分研究工作，在“Clinical Cancer Research(影响因子8.19)”参与发表一篇研究论文（见附件）。