microRNA调控参薯块茎形成的分子机制研究

Dioscorea alata (water yam) is widely grown in tropical and subtropical region and provides staple food for people in these areas. Water yam has high yielding but high variable tuber shape. Study for the mechanism of the tuberization process in water yam will assist the developing new water yam varieties with good tuber shape. MicroRNA is a class of important gene regulatory factor and widely involve in plant growth and development. In previous research, more than 10,000 protein coding genes and 100 miRNAs were detected with differential expression level between stem and stem tubers. Based on these data, we will conduct the following researches: 1) validating miRNA expression and screening candidate miRNAs related with the development of stem tuber in water yam; 2) predicting the target genes of candidate miRNA and analyzing the expression profiled of these targets genes; 3) constructing over expressed vector and knock-out vector of candidate miRNA and transforming to water yam to validate the gene function. We suppose to identify key miRNAs and reveal the regulatory effect of key miRNAs during stem tuber development and provide theoretical basis for developing new variety suitable for the production.

参薯在热带和亚热带地区有广泛种植，是热区人民主要粮食来源。参薯产量高，地下块茎形态多变，研究参薯块茎膨大的机制，可为培育合适薯型奠定理论基础。microRNA是重要的基因表达调控因子，广泛参与植物生长发育过程。在前期研究中，我们比较参薯叶片、匍匐茎和地下块茎的转录谱和小RNA数据，获得大量差异表达基因。根据高通量数据和文献报道的影响块茎发育miRNA，本研究拟开展对miR156、miR168等家族调控块茎发育的验证工作：1）验证miRNA表达，筛选参薯块茎发育相关的候选miRNA；2）预测并验证miRNA的靶基因，并分析其表达特征；3）构建块茎发育相关miRNA的超量表达和敲除载体，转化参薯鉴定miRNA的基因功能。通过以上研究，预期获得参薯块茎发育过程中关键调控miRNA，阐述关键调控miRNA在参薯块茎发育过程中的调控作用，为培育适合生产的块茎形态品种奠定理论基础。

参薯是热带和亚热带地区的重要块茎类作物，其块茎营养价值高，研究参与调控结薯过程的基因，可以为分子培育优良薯型品种奠定基础。本项目执行过程中，基于参薯基因组和各类高通量测序技术，获得基因组上小RNA的cluster共211,013个，其中miRNA的位点有125个，属于已知miRNA家族的基因位点97个，新miRNA基因位点28个，对应保守的成熟miRNA序列184条，新的成熟miRNA序列47条。根据31个参薯的叶、茎、节、块茎、零余子组织的小RNA和114个参薯转录谱数据，我们全面分析了所有miRNA基因位点pri-miRNA的表达特征、成熟miRNA在各组织的水平，获得全面的miRNA的表达信息，并使用RT-qPCR验证了32个组织特异表达的miRNA。基于参薯基因组预测的基因序列和114个转录谱拼接的转录本信息，我们预测了799条转录本为保守miRNA靶序列，302条转录本为新miRNA靶序列。根据转录谱数据，我们分析了靶基因和对应miRNA的表达特征，两者直接存在一定的负相关。使用RT-qPCR对参薯组培和盆栽材料未结薯的叶、茎，结薯状态的叶、茎和块茎进行miRNA和靶基因的表达水平消长分析，发现有大部分的miRNA与预测到的靶基因都存在比较明显的消长关系，并使用RLM-5’RACE和烟草瞬时表达的方法验证了miRNA和靶基因之间的互作。通过系统分析114个参薯转录谱中块茎和其他组织差异表达的基因，结合WGCNA构建块茎发育相关的共表达网络中的核心基因，筛选miR172为调控参薯薯块发育的关键基因。使用参薯腋芽转化体系，转化miR172的超表达载体，获得20多株独立转化的抗性株，通过PCR检测获得7株转基因材料。RT-qPCR结果显示miR172超表达的候选阳性株具有显著上升表达。由于野生型参薯响应光周期 ，且长日照促进结薯，我们对miR172超表达的株系进行光周期处理，发现其对光周期不敏感，且结薯时间平均提前近20天。本研究初步锁定参与调控参薯块茎形成的关键基因miRNA和靶基因，为应用基因资源于分子设计育种奠定了基础。