胆碱磷酸表面修饰的烟草花叶病毒用于基因载体的研究

In this program, tobacco mosaic virus (TMV) is utilized as small interfering RNA (siRNA) carrier for gene delivery into tumour cells, and then the recombinant TMV was modified on the surface by polyvalent choline phosphates to prepare a vector for gene delivery. The target gene was prepared as follows. Metastasis-associated in colon cancer 1 (MAACC1) was chosen as target gene. MACC1-siRNA plasmid was constructed using MACC1-siRNA fragment, which was digested with Xma I and Sac II restriction enzymes and then inserted into the corresponding unique site on pTMV U3/12-4, replacing the 126K replicase sequence. The recombinant plasmid was cut at the unique Kpn I site and recombinant RNA was transcribed from the linearized plasmid using the MEGAscript T7 kit. Finally, TMV-CPn-MACC1-siRNA gene carrier was self-assembled by recombinant RNA and coat protein of TMV. .We will investigate the gene vector effect on growth, proliferation and apoptosis of tumour cells, moreover, the treatment effect of tumour tissue will be invesgated by in vivo.

本项目将对重组烟草花叶病毒（TMV）表面以胆碱磷酸（CP）进行多价化修饰，制备植物病毒类基因载体材料（TMV-CPn）。用结肠癌转移相关基因1（MACC1）作为目的基因，利用TMV U3/12-4质粒的两个限制性内切酶位点Xma I和Sac II，将MACC1的小干扰RNA（siRNA）序列替换到TMV 126K复制酶序列的位置，构建重组MACC1-siRNA质粒，并在TMVU3/12-4质粒的Kpn I位点进行酶切，形成线型质粒，再用MEGAscript T7试剂盒转录合成重组RNA。将转录重组RNA与TMV外壳蛋白重新自组装后构建烟草花叶病毒-目的基因的基因载体（TMV-CPn-MACC1-siRNA）。.我们将以乳腺癌细胞等癌细胞系检测TMV-CPn-MACC1-siRNA对于癌细胞的生长、增殖及凋亡的影响，并在裸鼠体内构建肿瘤模型，进一步评价该基因载体对肿瘤的治疗效果。

基因治疗通过将治疗基因递送至病变细胞如肿瘤细胞中，调节或补偿异常基因而达到治疗的目的，是治疗癌症的最具潜力的方法之一。但是，作为带负电的生物大分子，游离的核酸是无法跨越细胞膜进入细胞起到治疗作用的。为了提高基因治疗效果，研究人员设计并合成了各种基因递送系统，以提高核酸药物的细胞摄取效率。随着基因载体的发展，阳离子聚合物因其出色的转染效率而获得了广泛的研究。阳离子聚合物携带的高正电荷赋予它们与核酸的强结合力以及与生物膜的相互作用，提高了基因转染效率。较高的正电荷带来了一个致命的问题是细胞毒性。高效与生物安全性之间的矛盾严重限制了阳离子聚合物的临床应用。因此，同时兼具高效和安全性的基因递送载体仍然被迫切需要。为了解决上述非病毒类基因载体存在的问题，本项目重点从以下三方面工作展开：(1) 功能型多肽基因载体材料，(2) 氧化-还原响应的氢键环化酯类基因载体材料，(3) 冠醚锁基因载体。以上三种方案，均实现了基因络合能力、细胞内吞效率与基因转染效率等均显著增强，而且能够有效在肿瘤部位蓄积，获得更佳的治疗效果，同时毒性明显降低于商用转染试剂PEI。上述方案为设计基因转染效率更高的基因传递系统提供新的途径，在生物和生物医学领域具有广阔的应用前景。在本项目的资助下，培养了2名博士研究生，2名硕士研究生直博，项目负责人以通讯作者累积发表SCI论文13篇。