ADCY4基因甲基化通过影响雌激素信号通路调控自然绝经的分子机制研究

Changes of the human gene methylation is associated with menopause and senescence. However, the specific molecular mechanism of methylation regulating natural menopause is unclear. The sequencing of the whole genome methylation of ovarian cortex in our early work showed that the map of ovarian methylation was significantly changed after menopause. After the expression of methylation differential genes was detected by RT-PCR, ADCY4 was selected as candidate gene. So, we guess that the ADCY4 gene methylation may regulate the occurrence of natural menopause by affecting the estrogen signaling pathway and follicular development. This project would over-expressed and RNAi-expressed ADCY4 gene of granulosa cells, and detect the expression of estrogen signaling genes; would use demethylating agents and a variety of lentiviral vector transfected granulosa cells to make ADCY4 gene hypermethylation and demethylation, then detect the effect of estrogen signaling pathway and granulosa cells; finally would use CRISPR/Cas9 system making ADCY4-knockout mice model to detect sex hormone expression and follicle development in these mice. On the whole, we aim to verify that ADCY4 methylation regulates the estrogen signaling pathway and follicular development, and thus participates in the molecular mechanism of menopause. The results of this project will provide new ideas and theoretical basis for prolonging female reproductive life and improving the quality of life after menopause.

绝经及衰老与人体基因甲基化图谱改变相关，然而甲基化参与自然绝经的具体分子机制尚不清楚。我们前期对女性卵巢皮质全基因组甲基化测序发现：绝经后卵巢甲基化图谱发生显著改变；通过RT-PCR检测甲基化差异基因的表达，筛选出ADCY4作为候选基因。我们猜想ADCY4基因甲基化可能通过影响雌激素信号通路以及卵泡发育来调控自然绝经的发生。本项目拟：过表达及RNA干扰颗粒细胞的ADCY4基因表达，检测其对雌激素信号通路基因表达的影响；利用去甲基化试剂及多种慢病毒载体转染颗粒细胞，检测ADCY4基因高甲基化和去甲基化对雌激素信号通路和颗粒细胞的影响；最后用CRISPR/Cas9系统制备ADCY4基因敲除小鼠模型，检测性激素表达和卵泡发育的情况。以此验证ADCY4基因甲基化调控雌激素信号通路以及卵泡发育，从而参与绝经发生的分子机制。本项目研究结果将为延长女性生殖寿命，改善绝经后生活质量提供新思路和理论依据。

卵巢颗粒细胞，是卵巢类固醇激素的主要来源。对于规律的月经周期及维持女性的性激素都有重要意义。前期研究中发现绝经后正常卵巢皮质组织ADCY4、PPP1CB等表达明显低于绝经前正常卵巢组织。ADCY4和PPP1CB参与调节多种细胞过程，包括细胞周期、细胞分化和凋亡。故我们猜想ADCY4、PPP1CB是否与卵巢颗粒细胞的增殖与凋亡相关。目前尚无ADCY4、PPP1CB参与颗粒细胞增殖与凋亡的相关研究。.本研究利用慢病毒转染KGN细胞调控ADCY4、PPP1CB基因，研究其对细胞增殖与凋亡的影响，利用磷酸化蛋白组学方法寻找并验证上下游通路。期待为治疗颗粒细胞相关疾病提供新的靶点。目的：本研究旨在评估ADCY4、PPP1CB参与许多蛋白的去磷酸化，是否调节从人卵巢颗粒细胞衍生的KGN细胞的增殖和去磷酸化。.方法：采用IHC法检测绝经后卵巢组织标本和正常未绝经卵巢组织标本的PPP1CB。我们利用不同的慢病毒载体来调控PPP1CB的表达，并通过WB和RT-PCR进行检测。采用CCK-8、EDU、Caspase3/7、Annexin V-APC检测和流式细胞术检测KGN细胞的增殖、凋亡和细胞周期。在PPP1CB沉默后，我们利用磷酸化蛋白质组学来鉴定显示差异表达的蛋白。.结果：绝经前后卵巢皮质中PPP1CB的表达水平显著升高。我们发现过表达PPP1CB促进有丝分裂进入，促进KGN细胞的增殖，而敲低PPP1CB导致细胞周期阻滞在G1，并诱导KGN细胞凋亡。PPP1CB沉默后，共鉴定出KGN细胞中表达的3230个蛋白，其中984个蛋白存在差异表达。前6个枢纽差异下调的磷酸化蛋白包括ENSA、NCL、MAPK1IP1L、STMN1、CALD1和SERF2，其中大部分与细胞分裂相关。.结论：我们的研究结果表明ADCY4、PPP1CB调控人卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡，揭示了一种很有前途的卵巢颗细胞凋亡相关治疗方法 。