GRK2在吗啡致痛敏过程中作用机制研究

Morphine is on of the most important drugs of pain clinic. But morphine can induce hyperalgesia, tolerance, and addiction. These side effects of morphine impact severely its therapeutical effect. By now, the mechanism of hyperalgesia caused by morphine is not clear. G protein couple receptor kinase 2 (GRK2) is a key protein which can regulate GPCRs by phosphorylation. Previous studies showed that the expression of GRK2 decreased in central nervous system in neuropathic pain model and inflammatory model. In our previous experiments, morphine tolerance and hyperalgesia were observed and the expression of spinal GRK2 was downregulated in rats model, which suggested that the decrease of GRK2 was involved in morphine induced hyperalgesia. However, the role of GRK2 on morphine induced hyperalgesia is not well understood. In this project, we will establish morphine induced hyperalgesia in rats and investigate the role and mechanism of GRK2 by ethology, morphology, and molecular biology. We hope to elucidate the molecular mechanism of GRK2 and investigate the potential target of pain clinic.

吗啡是治疗疼痛最重要的药物之一，长期使用吗啡会引起疼痛过敏、耐受和依赖等症状，吗啡引起的副作用严重影响了吗啡的镇痛效果，关于吗啡引起疼痛过敏的机制目前尚不清楚。G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）是催化G蛋白偶联受体磷酸化并启动G蛋白偶联受体脱敏的关键蛋白。既往研究表明，在神经病理性痛、炎性痛过程中脊髓及大脑某些核团GRK2表达降低，我们的前期工作表明给大鼠长期应用吗啡，可以观察到大鼠对吗啡耐受以及痛敏的产生，在脊髓我们还观察到GRK2表达水平降低，提示GRK2降低与吗啡致痛机制有关，但是GRK2在吗啡致痛敏过程中的具体作用尚不清楚。本课题旨在制备吗啡致痛大鼠模型，综合应用行为学、形态学、分子生物学等研究方法，研究GRK2在吗啡致痛过程中的作用及分子机制，阐明吗啡致痛敏的作用机理，为临床治疗顽固性疼痛及疼痛过敏提供新的思路和靶点。

吗啡是治疗疼痛最重要的药物之一，长期使用吗啡会引起疼痛过敏、耐受和依赖等症状，吗啡引起的副作用严重影响了吗啡的镇痛作用，关于吗啡引起疼痛过敏的机制目前尚不清楚。G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）是催化G蛋白偶联受体磷酸化并启动G蛋白偶联受体脱敏的关键蛋白。既往研究表明，在神经病理性痛、炎性痛过程中脊髓及大脑某些核团GRK2表达降低，我们的前期工作表明给大鼠长期应用吗啡，可以观察到大鼠对吗啡耐受以及痛敏的产生，在脊髓我们还观察到GRK2表达升高，提示GRK2升高与吗啡致痛敏机制有关，但是GRK2在吗啡致痛敏过程中的具体作用尚不清楚。本研究利用反复给予吗啡的方法制备了吗啡致痛敏动物模型，行为学检测表明反复多次吗啡之后，大鼠缩足阈值（PWT）和缩足潜伏期（PWL）显著下降（p＜0.05）；免疫荧光染色实验和western blot实验表明，在痛觉过敏大鼠的脊髓背角GRK2表达显著增加（p＜0.05）。同时免疫荧光染色实验还观察到β-arrestin 2表达趋势与GRK2一致；免疫荧光染色双标染色证实GRK2与阿片受体MOR和KOR存在共定位，与信号分子p38 MAPK共表达。利用立体定位注射技术将病毒载体介导的GRK2-shRNA注射到脊髓背角L4-L5节段，western blot检测表明GRK2表达下降约70%，大鼠的痛敏得到缓解；同样利用立体定位注射技术将病毒载体介导的GRK2注射到脊髓背角L4-L5节段，western blot检测表明GRK2表达增加3倍左右，大鼠的痛敏加重；体外分离培养大鼠脊髓神经细胞，分别感染腺相关病毒干涉载体AAV2-CMV-GRK2-shRNA和过表达载体AAV2-CMV-GRK2，cAMP检测表明GRK2可引起细胞内cAMP含量升高，[Ca2+]下降。我们的研究结果提示GRK2参与了吗啡致痛敏的形成，为临床治疗顽固性疼痛及疼痛过敏提供新的思路和靶点。