小麦光周期基因Ppd-B1的DNA甲基化调控机理及应用研究

Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the world's most important food crops. Photoperiod insensitivity (day neutral phenotype) enabled wheat adapt to a broad range of environments and expand the scope of introduction of new varieties. Photoperiod-B1a (Ppd-B1a) is one of the major genes that confers photoperiod insensitivity in wheat. Our previous study suggested that DNA methylation in the regulatory region of Ppd-B1 alleles conferred photoperiod insensitivity. This project will further investigate the mechanisms of DNA methylation underlying the photoperiodic regulation of Ppd-B1. Using bisulfite genomic sequencing, we will investigate the features of DNA methylation and geographical distribution. Using 5-azaC demethylation treated and screening methylation segregated NILs to study the relationship between DNA methylation and gene expression. Using site-directed mutagenesis, transient expression and genetic transformation assays to explore the key regulatory elements of Ppd-B1 promoter. Using ChIP and restriction enzyme accessibility assays to study the histone modificaiton and chromatin condensation states. Meanwhile, a methylation molecular marker will be developed to assisted select the fine pedigree with excellent agronomic traits. Our study will provide the basis for understanding the mechanisms of photoperiodic regulation of Ppd-B1 as well as establish a theoretical guidance for molecular breeding of heading date of wheat.

小麦（Triticum aestivum L.）是全球重要粮食作物，光周期不敏感特性能够提高小麦地域适应能力，扩大引种范围。Ppd-B1是控制小麦光周期反应的关键基因。前期研究发现，Ppd-B1启动子甲基化水平影响光不敏感位点形成。本项目拟继续系统研究Ppd-B1光周期调控的DNA甲基化分子机理：通过亚硫酸氢钠测序法，研究不同环境条件下Ppd-B1甲基化特征及地域分布特征；通过去甲基化试剂处理及筛选甲基化分离近等基因系，研究甲基化与基因表达的关系；通过定点突变、瞬时表达及遗传转化，探究Ppd-B1启动子区的关键调控元件；通过ChIP和限制性内切酶可接近性试验，分析Ppd-B1组蛋白修饰及染色质凝聚状态。同时开发Ppd-B1甲基化分子标记，对综合农艺性状优良家系进行分子标记辅助选择。研究结果拟为揭示小麦Ppd-B1基因光周期调控的甲基化机理奠定基础，并为小麦抽穗期分子育种提供理论指导。

开花是植物由营养生长向生殖生长转变的重要过程，光周期是调控这一过程的关键环境因素之一。生物钟系统处于光周期途径的关键位置，使植物感受外界环境的变化并在合适的时间完成生长发育过程。小麦光周期基因Photoperiod-1（Ppd-1），为生物节律钟系统输出信号途径控制成员，在小麦“绿色革命”中发挥了重要作用。本项目从DNA序列、基因表达、组蛋白修饰等多角度解析Ppd-B1基因响应光周期调控的甲基化分子机理。利用亚硫酸盐测序法分析了不同光周期条件下Ppd-B1基因甲基化特征。利用荧光定量PCR技术分析了Ppd-1基因在不同时期不同部位的表达特征。利用酵母单杂交筛库和ChIP-qPCR技术，分析了Ppd-B1启动子结合蛋白及组蛋白修饰特征。项目同时利用全基因组关联分析及转基因策略，系统研究了Ppd-A1、B1、D1不同单倍型与小麦产量和籽粒相关性状的关系，并发现优异单倍型在小麦育种中受到定向选择。全基因组关联分析结果显示，Ppd-1-Hapl A1、B1和D1为优异单倍型，具体表现为Ppd-1-Hapl A1能够增加穗长4.72%–5.93%，Ppd-1-Hapl B1和D1分别能够降低株高5.64%–13.08%和13.62%–27.30%，以及提高千粒重4.89%–10.94%和11.12%–21.45%。转基因水稻研究结果显示，过表达Ppd-D1在长日照条件下，能够延迟抽穗期、降低株高以及降低千粒重。对转基因水稻籽粒相关性状研究显示，过表达Ppd-D1能够显著减少籽粒宽度和籽粒面积，并降低籽粒蛋白质含量。结合中国小麦育种40年数据，发现优异单倍型Ppd-1-Hapl A1、B1和D1均受到了定向选择，其分布频率分别由地方品种的26.09%、60.00%和52.00%分别提高至2010s年代的42.55%、93.62%和96.23%。与此同时，本项目开发的Ppd-B1甲基化分子标记可用于辅助小麦育种及人工选择。本研究对于充分探究Ppd-1基因功能及其基因资源多样性，有效利用其优异单倍型，进而提高作物产量和品质均具有重要意义。