酵母菌铁载体新合成途径菌株的构建及其铁载体合成与调控的研究

Siderophores are important metabolites synthesized by microorganisms to concentrate and absorb iron from living environments. They also have highly potential applications in medicine and maricultural industries. However, siderophore biosynthesis in yeasts must start from L-ornithine which is an expensive and rare amino acid. In this project, in order to avoid supplementation of L-ornithine in the medium, a new siderophore biosynthesis pathway in the yeast strain HN6.2, which could produce high level of siderophore called Fusigen, will be constructed and the new recombinant strain which has new siderophore pathway can synthesize siderophore from glucose directly. Then, the investigation on relationship between L-ornithine-N5-monooxygenase，NRPSs as well as their genes and siderophore biosynthesis and regulation will be carried out based on transcriptomics and modern gene technology within the new pathway strain. Therefore, in this study, siderophore biosynthesis and regulation in the recombinant strain will be investigated based on the completely new concept and the siderophore fusigen will be directly and efficiently produced from glucose by the newly constructed yeast strain.

铁载体是微生物自身合成的、用于从环境中浓缩和吸收铁营养的一种代谢产物，铁载体在人类铁代谢疾病的治疗和预防、在水产动物疾病防治和环境保护等方面具有重要的用途。但是铁载体合成需要添加外源的稀有L-鸟氨酸。在本项目中，将在高产铁载体Fusigen的酵母菌HN6.2菌株中构建一个能利用葡萄糖直接合成铁载体的新途径，避免添加昂贵的外源L-鸟氨酸。然后利用转录组学和现代基因工程技术研究L-鸟氨酸-N5-羟化酶、NRPSs及其基因和新途径菌株中铁载体合成与调控的关系。所以本项目将使用全新的概念研究酵母菌铁载体的合成和调控，并为酵母菌廉价高效生产铁载体Fusigen提供重要技术基础。

铁载体对金属离子的高亲和力，使其在多个领域中应用广泛。最近，铁载体在人类病原体感染诊断和治疗中的医学应用受到越来越多的关注。Fusarinine C（FsC）是一种天然的异羟肟酸类铁载体，分子中含有三个氨基，极易通过化学方法对其进行修饰从而设计新的多功能络合物。然而，由于FsC产量较低，使得FsC难以被广泛应用。本研究拟在该菌株中构建一条全新高效的FsC的合成途径。本研究首先对A. melanogenum HN6.2菌株其进行了基因组测序和挖掘。研究发现该菌株是同时存在已知的四种铁获取机制的酵母物种，这四种铁获取机制为（i）铁载体介导的铁摄取; （ii）还原铁同化; （iii）低亲和力的铁吸收; （iv）血红素利用。该菌株在铁获取上更加灵活和多元化，因此在严酷环境中较其他酵母和真菌有更强的适应性。进一步的HPLC和Q-Tof-MS分析证实，该菌株可以产生五种铁载体FsC、FsB、FC、HFC和一种未知结构的铁络合物。基于这一结果，本项目进一步结合基因组注释解析了该菌株完整的铁载体合成途径。对于铁内稳态，转录组分析显示该菌株的铁内稳态调控运用了SreA/HapX调控回环，并且其MpkC也在铁内稳态中扮演着重要的角色。这是A. melanogenum铁获取和内稳态的第一个基因蓝图。进一步，本研究基于HN6.2菌株的铁载体合成途径，通过构建的该菌株基于Cre/lox原理的连续遗传改造系统重构了该菌株中的FsC合成途径，通过敲除旁路FC/HFC合成途径中的基因，超表达FsC合成途径中的基因，获得L-鸟氨酸底物自供应、组分简化且产量提高的铁载体合成菌株，最终FsC产量约1.7g/l。这是目前已报道的FsC的最高产量。