Notch信号通路在非血管化游离输送盘牵张成骨模式中调节血管形成和血管生成的机制研究

Transport Distraction Osteogenesis (TDO) technique has a broad clinical application in craniomaxillofacial surgery because of its irreplaceable advantages. But TDO does not work for those patients who can't make an appropriate bone transport disc for TDO by their own bone segment because of the large bone defect or residual bone, so we put forward a new pattern of TDO that is Nonvascular Transport Distraction Osteogenesis (NTDO) and it provides a new possibility to solve the problem. Based on the successful construction and test of the NTDO animal model, in order to further our research on NTDO's mechanism, we will integrate the new induced factor Notch1 ICN into the bone marrow endothelial progenitor cells by gene transfection, construct the notch signaling in the bone marrow endothelial progenitor cells and detect the expression of the target gene after activating the Vascular endothelial progenitor cells ( EPCs ). We will also study the mechanisms of Notch's signaling and its regulation of Angiogenesis during NTDO. The study can further clarify the mechanism of new bone formation in NTDO and provide a theoretical basis for NTDO's clinical application in treating serious bone defect or bone deformities.

牵张成骨技术因其本身许多无可替代的优越性使其在颅颌面外科领域具有广阔的应用前景，但对于那些骨质缺损过大、剩余骨量不多难以利用自身骨段制作输送盘的患者来说却难以奏效。我们提出的"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"为这一问题的解决提供了可能。我们在成功构建并验证"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"动物模型的基础上，为进一步探明其机制，本课题拟用Notch1 ICN作为细胞诱导因子，利用基因转染的方法将其导入骨髓内皮祖细胞，构建骨髓内皮祖细胞内的Notch 信号转导通路，检测激活血管内皮祖细胞Notch 信号通路后靶向基因的表达情况，研究Notch 信号通路在"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"新骨形成中调节血管新生的机理，从而进一步阐明"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"新骨形成机制，为进一步在临床上广泛应用"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"治疗各种严重骨缺损或骨畸形提供理论依据。

目的.本研究应用血管内皮祖细胞作为种子细胞，拟通过激活EPCs内的Notch信号转导通路，研究Notch信号转导通路在牵张区新生血管的系列分子调控事件，进一步阐明“非血管化游离输送盘牵张成骨”模式中的新生血管形成机制，为“非血管化游离输送盘牵张成骨”提供理论依据。.方法.体外分离培养鉴定同种异体内皮祖细胞，通过hNotch1.ICN基因修饰EPCs，研究该基因修饰后对EPCs生物学行为的影响。应用基因修饰后细胞进行Notch信号通路促进非血管化输送盘牵张成骨血管新生的动物实验，于牵张固定期1周、2周、4周后，通过大体观察、X线片观察新骨形成和改建情况；通过HE染色观察牵张区新生血管的结构；通过CD105免疫组织化学和Chalkley法来进行血管生成数量的定量检测；通过实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、Western blot法检测牵张区血管生成因子VEGF-1和Ang-1 mRNA和蛋白表达情况。.结果.成功构建了Notch1．ICN慢病毒表达载体，过表达hNotch1.ICN对对EPCs的生存活力没有显著影响；可增强EPCs抗凋亡能力；流式细胞仪检测在EPCs过表达hNotch1.ICN基因使处于G2期的EPCs细胞增多；过表达hNotch1.ICN基因促进了EPCs与活化内皮细胞粘附，促进EPCs跨内皮迁移，促进EPCs管样结构形成。qPCR和Western blot法检测慢病毒转染EPCs后结果显示，Notch信号下游信号分子Hes 1和Hey 1的mRNA和蛋白表达均增加。动物实验标本显示牵张区新骨均愈合良好，新生血管的数量随着时间推移呈梯度递减趋势， VEGF-A、Ang-1蛋白表达随固定时间的延长，表达逐渐降低。.结 论..1. 过表达hNotch 1.ICN 促进了Notch信号下游效应分子Hes 1、Hey 1基因及蛋白的表达；持续活化的Notch 1信号不影响EPCs存活，但使细胞周期阻滞于G2期，延缓了细胞周期的进展，使其不进入下一轮细胞周期，抑制了EPCs的分化；增强了EPCs的抗凋亡能力。.2. Notch 1.ICN过表达能够促进 EPCs与活化内皮细胞的粘附、跨内皮迁移以及管腔样结构的形成。.3.证实了Notch 1.ICN基因治疗是通过Notch信号上调血管生成因子VEGF-A与Ang-1的表达来促进非血管化输送盘牵张区血管的新生