基于血小板活化介导的血管生成探讨三棱丸治疗克罗恩病肠纤维化机制研究

Studies have revealed that angiogenesis is tightly linked to fibrotic disease, and the platelet activation is not only an important indicator of the clinical activity of Crohn's disease (CD), but also a significant way to mediate angiogenesis. In our previous study, Sparganium Pill has a therapeutic effect to CD patients with intestinal fibrosis (IF), which had been verified elementarily in the laboratory research. It is of great significance to clarify the mechanism for clinic treatment of IF. Based on the finds above, we propose the hypothesis that angiogenesis of intestinal microvascular Endothelial Cells (IMECs) mediated by platelet activation regulates HIF-lα through the key signaling pathway of PI3K/AKT/mTOR and resluts the final formation of IF, and Sparganium pill plays the role of anti IF by regulating the angiogenesis through the pathway mentioned above. In order to clarify the hypothesis further, we plan to study systematically the effect on the platelet activation, angiogenesis and fibrosis of intestinal fibrosis model, the intervention in angiogenesis of IMECs mediated by platelet activation in vitro by Sparganium Pill with the technologies of immunohistochemistry, immunofluorescence, Western blotting, RT-PCR, siRNA and so on. Around the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway of angiogenesis regulation, the results from this study will reveal the molecular mechanisms of Sparganium Pill treating IF and provide the scientific evidences for clinical application.

研究显示，血管生成与纤维化疾病关系密切，而血小板活化既是克罗恩病（CD）临床活动度的重要指标，亦是介导血管生成的重要途径。我们前期研究发现：三棱丸对CD患者的肠纤维化（IF）疗效明确，并在实验室研究中初步得到证实，明确其作用机制对临床治疗具有重要意义。在此基础上我们提出假说“肠微血管内皮细胞（IMECs）的血管生成由血小板活化通过PI3K/AKT/mTOR关键信号通路介导，并调控HIF-lα，继而形成IF；三棱丸通过这一通路调控血管生成，发挥抗IF作用。”为进一步阐明假说，采用免疫组化、免疫荧光、Western blotting、RT-PCR和siRNA干扰等技术手段，系统研究三棱丸对大鼠肠纤维化模型血小板活化、血管生成、纤维化的作用，及对血小板活化介导的IMECs血管生成的干预，围绕调控血管生成的PI3K/AKT/mTOR信号通路，阐明其治疗IF的分子作用机制，为临床治疗提供依据。

肠道炎症导致的肠纤维化性狭窄是克罗恩病（Crohn Disease，CD）常见并发症。而中医药在治疗CD方面具有独特的优势，发挥了良好的疗效。本研究主要着眼于血小板活化介导的血管生成在三棱丸方治疗CD的肠纤维化中的作用机制。首先通过建立肠纤维化大鼠模型，观察三棱丸复方对大鼠肠纤维化组织的血管生成的影响；通过三棱丸含药血清作用于活化血小板刺激的肠微血管内皮细胞（Intestinal Microvascular Endothelial Cells IMECs），进行IMECs细胞的活力测试（MTT实验）、毒性测试——乳酸脱氢酶（LDH）释出测定、毛细血管管腔形成（Capillary Tube Formation）及IMECs迁移（Migration）实验；检测血管生成相关因子、纤维化相关因子及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白，评价三棱丸含药血清对IMECs血管生成及EMT的作用；再通过使用PI3K/mTOR抑制剂BEZ235和SiRNA技术来探究三棱丸通过血小板活化介导的IMECs的血管生成对IMECs的EMT作用的机制。研究结果表明，三棱丸含药血清明显下调IMECs中的VEGF浓度、I型胶原、α- SMA、E-cadherin、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和HIF-1α蛋白表达水平，能够抑制细胞迁移和血管管腔形成；活化的血小板刺激HIF-1α核转位，而三棱丸处理后能够抑制这一趋势；应用PI3K/mTOR抑制剂BEZ235处理后，PI3K/AKT通路相关蛋白磷酸化水平明显受到抑制，HIF-1α表达受抑制；之后我们再应用SiRNA干扰HIF-1α，观察活化血小板上清诱导后的IMECs，与对照组相比，HIF-1α明显受抑制，而上游的PI3K/AKT、mTOR及磷酸化水平未见明显变化。本研究发现三棱丸可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，抑制活化血小板诱导的IMEC细胞迁移和血管生成，调控HIF-lα，继而抑制肠纤维化进程。本课题在“活血化瘀”中医理论指导下，从血小板活化入手，抓住血管生成及肠纤维化的关键枢纽性因子HIF-lα，明确了血小板活化对肠纤维化的作用机制及三棱丸活血化瘀治疗肠纤维化的机理，为中医活血化瘀治疗肠纤维化提供新的思路和理论依据，为CD的肠纤维化性狭窄的中医治疗及相关药物开发提供新的视角，具有极其重要的理论和现实意义。