鲱精胺脱亚胺酶代谢通路对单增李斯特菌抗酸应激能力的影响及其分子作用机制

单核细胞增多性李斯特菌是重要的人兽共患食源性病原菌。酸是其最常遇到的不利环境因素之一，抵抗酸应激的能力是其建立感染的前提。但目前国内外对单增李斯特菌抗酸应激机制缺乏系统深入的研究。申请者通过Solexa基因表达谱分析技术比较单增李斯特菌在中性与酸性环境中的全基因组表达水平差异，发现基因岛lmo0036-lmo0041在酸性环境的表达量显著上升。该基因岛特异性存在于致病性李斯特菌，编码完整的鲱精胺脱亚胺酶（AgDI）系统。本项目拟综合运用病原生物学、分子生物学、生物化学、细胞生物学等技术，系统研究：（1）AgDI代谢通路对细菌抗酸应激的影响；（2）AgDI代谢通路与细菌致病性的关系；（3）AgDI系统的分子作用机制。研究结果为进一步探明单增李斯特菌如何抵御体内外的低pH应激，从而引发疾病奠定基础；并从代谢组学角度，为建立以单增李斯特菌作为模式菌的新型抗菌药物靶标筛选技术体系提供重要线索。

单核细胞增多性李斯特菌是重要的人兽共患食源性病原菌。酸是其最常遇到的不利环境因素之一，抵抗酸应激的能力是其建立感染的前提。鲱精胺脱亚胺酶AgDI通路与细菌抗酸应激密切相关。本研究证实该系统内：ArcB兼具鸟氨酸氨甲酰转移酶（OTC）与腐胺氨甲酰转移酶（PTC）的活性。同化反应的最适pH呈碱性（pH 8~pH 10），而异化反应的最适pH为酸性（pH 5~pH 5.5）。OTC与PTC活性分别推进了ADI代谢通路与AgDI代谢通路。ArcB将这两条代谢通路联系起来，发挥承前启后的关键作用。氨甲酰磷酸盐在氨甲酰激酶CK（lmo0039）的作用下，生成二氧化碳与氨。而鸟氨酸与腐胺通过跨膜转运因子AP（lmo0037），与胞外的精氨酸或鲱精胺进行等量交换，启动新一轮的ADI与AgDI代谢循环。该循环处于动态平衡之中。在1个ADI或AgDI循环中，1 mol精氨酸或鲱精胺生成2 mol氨。在酸性环境中，氨与细胞质中的H+结合为NH4+，提高细胞质的pH，以减轻酸应激对细胞的伤害，从而增强细菌的抗酸应激能力。双拷贝鲱精胺脱亚胺酶AgDI（AguA1和AguA2）均具备与其催化活性相关的5个氨基酸活性位点（C356、D94、D218、H216和E155）。两者在酸应激后转录水平均显著上调，但证实只有aguA1介导细菌的体内和体外抗酸应激过程。重组表达的AguA1能够高效且特异性地催化鲱精胺，比活力高达2050.78 U/mg，而AguA2无活性。AguA1的酶动力学参数Km、Vmax、kcat和kcat/Km值分别为0.65±0.23mM、85.69±7.58μM/min、34.28±3.03min-1和5.30×104 min-1M-1。AguA1的催化位点C356、D94、D218、H216和E155中任意一位突变后其活性均完全丧失。将AguA2特异性差异位点突变为AguA1中对应的氨基酸后发现AguA2天然无活性的原因主要是由于第157位Cys引起，突变成Gly后具有高活性，而将AguA1该位点进行G157C突变，其活性完全丧失。因此本研究系统地揭秘了AgDI通路参与细菌抗酸应激的分子机制且首次证实G157为AgDI的关键位点。