基于内生真菌开发新型β-内酰胺酶抑制剂的研究

Development of novel β-lactamase inhibitor is one of the effective approaches to control bacterial resistance. Currently new natural β-lactamase inhibitors are primarily searched from metabolites of microorganisms growing independently in nature. Endophytic fungi, with their unique ecological niche different from free-living microbes, have been considered as a new source of novel compounds in recent years. Our preliminary studies showed that some endophytic fungi produced metabolites capable of inhibiting various β-lactamase activities. There are abundant endophytic fungi in our country. We have initially constructed libraries of endophytic fungi and their metabolites. For further exploitation of novel β-lactamase inhibitors from metabolites of endophytic fungi, this project will use clinically the most halmful β-lactamases as drug targets, expand the library of endophytic fungi and their metabolites, establish high throughput biochemical screening to identify β-lactamase inhibitors from the natural product library of endophytic fungi, analyze the phylogenetic relationship among the endophytic fungi producing β-lactamase inhibitors, and study the physico-chemical property, efficacy and toxicity of the effective compounds. This project will provide the basic data and theoretical foundation for further development of new β-lactamase inhibitor drugs from endophytic fungi.

开发新型β-内酰胺酶抑制剂是控制细菌耐药性的有效手段之一。目前从天然产物中寻找和开发新型β-内酰胺酶抑制剂所用的材料基本为自然条件下独立生长的微生物代谢物。内生真菌的生境不同于上述微生物，近年来研究显示内生真菌是发现新化合物的源泉。我们研究发现有些内生真菌的代谢产物能够抑制β-内酰胺酶活性，是寻找和开发新型β-内酰胺酶抑制剂的新材料。我国内生真菌资源丰富，我们已初步构建了内生真菌库及其代谢产物库。为了深入探索从内生真菌中开发新型β-内酰胺酶抑制剂，本项目将选择目前对人类健康潜在威胁最大的多种β-内酰胺酶为药靶，建立β-内酰胺酶抑制物的高通量生化筛选方法，进一步扩大内生真菌库及其代谢产物库并从中筛选β-内酰胺酶抑制物，分析β-内酰胺酶抑制物产生菌的系统发育关系，初步研究具有抑制β-内酰胺酶活性的有效成分的理化性质、药效及毒性，为从内生真菌中开发新型β-内酰胺酶抑制剂提供基础数据及理论依据。

细菌耐药性问题在世界范围内日趋严重。细菌产生分解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶是导致细菌耐药的主要机制之一，因此开发新型β-内酰胺酶抑制剂是控制细菌耐药性的有效手段。我国内生真菌资源丰富，但到目前为止尚未见从内生真菌中开发β-内酰胺酶抑制剂的系统研究，本项目在前期工作的基础上对此进行了探索。我们在开展研究的三年中，（1）通过查阅最新文献、走访临床医师、咨询资深专家等调研方式，从目前上千种β-内酰胺酶基因中选取了16种代表性的基因作为本项目的筛选靶标；（2）将选取的β-内酰胺酶基因进行了克隆和表达，制备了10种纯化的药靶蛋白，包括TEM-10，TEM-26，SHV-5，OXA-48，CTX-M-14，CTX-M-15，CMY-2，KPC-2，NDM-1，VIM-1等；（3）从全国不同地区采集植物样本并从中分离内生真菌，构建了较大规模的内生真菌库及其代谢产物库，其中包含8200株菌株和16400种代谢产物；（4）建立了β-内酰胺酶抑制剂的高通量生化筛选方法，从内生真菌库中筛选到28株具有抑制β-内酰胺酶活性的菌株，探测了其代谢产物提取物的抑制谱，其中12种提取物对美罗培南、头孢他定或氨苄青霉素具有增效效应；（5）分析了β-内酰胺酶抑制物产生菌的系统发育关系，发现产β-内酰胺酶抑制物的菌株在分类上分布较广，跨越了子囊菌的四个纲，在Trichocomaceae中分布较多。（6）携带blaNDM-1基因的“超级细菌”能够耐受除替加环素和多黏菌素外几乎所有的临床常用抗生素，且在世界范围内扩散，临床危害严重。我们从菌株PF001167代谢产物中分离到一个化合物，具有抑制十余种此类“超级细菌”的活性，其最低抑菌浓度低于绝大多少临床常用抗生素。另外，合成了系列含氟咔唑类化合物，其中部分化合物也具有此种活性，选测了两种有活性的含氟咔唑化合物的毒性，其LD50分别为595 mg/Kg和> 1000 mg/Kg。综上所述，本项目为从内生真菌中开发新型β-内酰胺酶抑制剂及相关药物进行了有益的探索，所获得的结果及数据具有较好的参考价值。