滇重楼GA20ox，GA3ox，GA2ox基因克隆鉴定及其在种子发育与萌发过程的表达规律研究

The seeds of Pairs polyphylla var yunnanensis have undeveloped embryos, and it was called Morphophysiological dormancy seeds. We　have acquired many of the transcriptome sequences (47768 unigenes)using high-throughtput 454-sequncing of Paris polyphylla seeds.By sequence alignment and annotation, many key gene sequences which invoved in GA synthesis and motablism were obtained,such as GA20ox,GA3ox and GA2ox. Based on these results, we will investigate the key genes and genes expression mode of GA 20-oxidase (GA20ox)，GA 3-oxidase(GA3ox) and GA 2-oxidase(GA2ox) genes in the seeds development and germination. These research include: Firstly, melocular cloning,phylogenetic and gene structure analysis of GA20ox,GA3ox and GA2ox family genes; Secondly, bioinformatics analysis of the three family genes based on nucleotide and anmino acid sequences; Thirdly, expression analysis of the three family genes in seeds stratification, plant growth regulator treatment and light treatment using RT-PCR,Northern blot methods; Finally,the function of GA 20ox, GA3ox and GA2ox genes cloned in this work will be validate by transgenic experiment. The implementation of this project will help us to deeply understand the role of GA in seed development and germination,and will provide important theoretical basis before sowing of this plant.

滇重楼种子的胚发育不完全，具有形态和生理休眠特性。本课题组前期应用高通量转录组测序技术得到了大量滇重楼种子转录组序列（47768 unigenes）。通过序列比对和注释，挖掘出了多个参与种子发育及萌发过程关键酶的基因序列，如参与GA合成与代谢相关的关键酶基因-GA20ox,GA3ox和GA2ox。本项目正是在此基础上,开展GA20ox,GA3ox和GA2ox基因的克隆鉴定以及基因的特异表达研究。主要研究内容为：GA20ox、GA3ox和GA2ox基因家族基因的全长序列克隆，并进行基因系统进化等分析；基于核苷酸和氨基酸水平的三个基因家族的生物信息学分析；应用RT-PCR，Northern 杂交等实验对三个基因家族在滇重楼种子层积过程、生长调节剂和光照处理过程中的特异表达研究；通过转基因实验进行克隆基因的功能验证。本项目的实施，将有助于我们深入理解滇重楼种子发育及萌发过程GA作用的分子机理。

滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）的地下根茎是著名的稀缺名贵中药材。近年来，滇重楼野生资源逐渐枯竭，而人工栽培的面积在逐步扩大。目前，虽然对滇重楼种子播种前处理促进其快速萌发的技术方法已经有了显著效果，但是其种子休眠解除的机理至今不明。研究表明，植物赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）在种子萌发中起着重要作用。GA20-氧化酶、GA3-氧化酶、GA2-氧化酶是GA合成与代谢过程中的关键酶，它们均由多基因家族编码，参与着GA水平的调控。本项目在前期研究基础上，挖掘可能参与GA调控代谢过程的关键酶基因，分析这些基因的序列特点、在滇重楼种子休眠解除过程的表达特点等，探索GAox基因在滇重楼种子休眠解除过程的功能。项目的研究内容包括：（1）前期转录组数据得挖掘及序列分析；（2）比较转录组研究及序列分析；（3）GAox基因序列克隆鉴定等；（4）GAox在种子休眠解除过程的表达规律研究；（5）GAox基因功能的验证。在我们前期的研究中，获得了234331条Unigenes序列。这些Unigenes序列中有96709条Unigenes序列有注释信息，其中15条Unigenes序列注释为GA2ox基因， 8条Unigenes序列注释为GA20ox基因，1条Unigenes序列注释为GA3ox基因。经过PCR扩增和验证得到6条GAox基因编码序列，包括PpGA2ox1-4 （1092,1032,978,969bp）,PpGA20ox1（1122bp）,PpGA3ox1（1050bp），并获得GeneBank注册（KY921589-KY921594）。对这6条基因在滇重楼种子休眠解除过程的表达规律进行了分析，发现其表达量的变化不同，值得进一步探讨。由于前期测序获得的序列信息少，我们又设计了在种子萌发过程5个不同时期取样，并进行了比较转录组分析，目的是能获得更多的序列信息完善研究内容。另外，在本项目中得到的初始测序数据提交到SRA数据库(SRR5947180, SRR5947181, SRR5947182, SRR5947183, SRR5947184) 组装后的数据提交的TSAs数据库 (GHCK00000000)。本研究发现，利用高通量测序得到的序列质量有比较大差异，后续的基因克隆和基因功能验证需要在序列的准确性、序列注释等方面做更多的研究工作。