低氧下SDF-1/CXCR4-JNK途径调节ABCG2对乳腺癌边缘群细胞生物学行为的影响及机制研究

The side population (SP) sorted from tumor cells, has been identified as cancer stem-like cells. As “seeds”, SP cells triggered the growth, invasion, metastasis and recurrence of tumor. It is important that to understand the biological behavior of SP cells and the mechanism of regulation under hypoxia condition, which will provide an opportunity to interference the tumor. ABCG2 confers to the major phenotype of SP cells and plays an important role in promoting stem cell proliferation and the maintenance of the stem cell phenotype. Our previous study showed that hypoxia up-regulated expression of CXCR4 and ABCG2 on the SP cells of breast cancer cell line MCF-7 and CXCR4 regulates the expression of ABCG2 under hypoxic condition, but the mechanism of regulation was not clear. In this study, we will first evaluate the role of ABCG2 on the biological behavior and function in SP cells. Secondly, by up- regulating or down-regulating the expression of correlative gene, the relevance of SDF-1 /CXCR4 axis–JNK/c-Jun -ABCG2 pathway and its role on biological behavior of SP cells will be confirmed. Thirdly, the c-Jun-binding site on the ABCG2 promoter will be evaluated using luciferase reporter, site-directed mutagenesis, chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) and electrophoresis mobility shift assay (EMSA). Finally, using immunodeficient mice, we establish the tumor transplantation model and Interfere SDF-1 /CXCR4 axis and JNK/c-Jun pathway in vivo, confirm the ability of SDF-1 /CXCR4 axis–JNK/c-Jun -ABCG2 pathway to regular biological behavior of SP cells.

肿瘤边缘群（SP）细胞被认为是肿瘤细胞内富集干细胞的细胞群，而被视为肿瘤生长、侵袭、转移和复发的“种子”。探讨低氧环境SP 细胞生物学特性及调节机制，将会为肿瘤的发生、转移机制研究以及抗肿瘤治疗开辟新的道路。ABCG2是肿瘤SP 细胞的功能蛋白，我们前期研究证实低氧环境下乳腺癌细胞系MCF-7 SP 细胞CXCR4与ABCG2增高，并证实了CXCR4可调节ABCG2的表达，但具体机制不详。本研究拟通过基因转染上调和下调相关通路基因，评价SDF-1/CXCR4 轴–JNK/c-Jun-ABCG2通路的关联性以及在SP 细胞生物学行为方面的作用；验证ABCG2启动子的c-Jun 结合位点，并利用免疫缺陷小鼠建立肿瘤移植模型，以SDF-1 /CXCR4 轴与JNK/c-Jun 通路作为调控SP 细胞生物学行为的靶点进行体内试验。以期完善乳腺癌干细胞起源、分化及调控机制，为患者提供新的治疗靶点。

ATP结合盒G超家族成员2（ABCG2）授予的侧群（SP）细胞的主要表型，提高了细胞在不利环境中的存活能力及药物抵抗能力，并维持SP 细胞的“干”性。在低氧环境下，乳腺癌细胞ABCG2的表达水平增高，产生化疗药物抵抗，所以研究低氧环境下ABCG2的调控机制尤为重要。.本次研究结果表明，低氧环境下乳腺癌SP细胞会表现出明显更高的CXCR4表达水平，球形成效率（SFE）和生长速率。 利用CXCR4的阻断剂AMD3100，可以逆转这一现象。 通过pcDNA-CXCR4转染的CXCR4过表达强力地增加了ABCG2的表达，并且促进了球体形成效率（SFE）和缺氧SP细胞的生长，同样AMD3100可以抑制这一现象。 此外，我们发现CXCR4促进c-Jun表达，这是JNK / c-Jun途径中的主要基因。 我们关于电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP）分析的数据都显示c-Jun可以直接与ABCG2启动子序列结合。 此外，JNK / c-Jun的过度表达促进了ABCG2的表达，SFE和细胞生长，并且这一现象可以通过c-Jun抑制剂SP600125逆转。.同时在试验中还发现使用Shh通路的抑制剂KAAD-cyclopamine，使低氧条件下的肾脏SP细胞中的Shh及Gli1蛋白表达水平发生明显下调，并抑制了低氧诱导的SP细胞中ABCG2的表达，同时也抑制了SDF-1激活组SP细胞中ABCG2的表达。.结论： SDF1-CXCR4能够通过JNK / c-Jun与Shh-Gli1途径促进ABCG2转录，同时低氧环境下ABCG2诱导促进的乳腺癌SP细胞生长能力及维持“干细胞”特性。 我们的研究结果进一步完善乳腺癌耐药机制，并且为治疗乳腺癌提供了新的目标和潜在的治疗策略。