siRNA沉默层粘连蛋白及整合素基因研究层粘连蛋白-整合素跨膜系统在难治性癫痫形成机制中的作用

研究表明生长锥异常生长，异常神经网络形成是癫痫难治性形成基础，层粘连蛋白-整合素系统是生长锥的分子生物学基础，前期对人类难治性癫痫脑组织的研究发现其明显高表达，阻断这个系统可能阻止难治性癫痫生长锥的异常生长，作为新的治疗突破点。课题组拟建立临床难治性癫痫细胞模型；在培养液中添加外源性层粘连蛋白，及siRNA对内源性层粘连蛋白进行表达沉默，研究外源性和内源性层粘连蛋白对海马细胞生长锥的影响；利用siRNA沉默层粘连蛋白及整合素基因，转染海马细胞，通过光电镜研究观察海马细胞的形态、超微结构和生长锥变化；对目标基因进行特异性表达沉默，检测海马细胞目标基因和蛋白表达。通过观察目标基因被抑制后海马细胞从基因到蛋白，生长锥从形态到各项生理生化的变化，对层粘连蛋白-整合素系统在难治性癫痫中的发病机制进行研究。

本实验室经过探索和优化新生大鼠海马神经元原代培养方法，建立良好的细胞培养平台；将培养第9天的细胞低镁细胞外液处理3小时后建立难治性癫痫细胞模型。采用全细胞膜片钳记录技术研究Sombati 癫痫细胞模型电压依赖性K+电流的变化，结果显示致痫组外向K+ 电流比正常组增大， I-V曲线明显左移，I-V 曲线形态无显著改变。低镁细胞外液处理海马神经元可诱导产生反复自发性癫痫样放电且终身具有反复自发癫痫放电的特征，与临床颞叶癫痫较为接近。.之后，利用分子生物学技术对Sombati癫痫细胞的Lamininβ1及Integrinα2基因及蛋白的表达进行了研究，证实Lamininβ1蛋白主要分布于海马神经元的胞浆和神经元周围的基质，Integrinα2蛋白主要分布在神经元细胞膜和神经轴突；造模后24h Lamininβ1mRNA及Integrinα2 mRNA均较正常组升高，在48h仍维持在较高水平，同期的倒置相差显微镜观察发现模型组的海马神经元细胞膜较粗糙，神经元之间的网格发现明显变化。Lamininβ1及Integrinα2基因及蛋白的高表达和神经元形态学的变化提示层粘连蛋白-整合素跨膜系统在难治性癫痫细胞模型的形成中发挥着重要作用。.培养液中添加外源性Lamininβ1蛋白，研究外源性Lamininβ1蛋白对海马神经细胞形态及生长锥的影响的研究。结果显示经低镁液处理后24h光学显微镜下可见神经元胞体相互靠近，神经突起相互迁移聚集，突起连接成网格样变化，72h时这种变化更加明显。扫描电镜下神经元胞膜粗糙，可见小凹陷形成，神经突起交织聚集。外源性Lamininβ1蛋白能促进神经元轴突的生长。.成功构建integrin β1基因的4个shRNA慢病毒干扰载体，经测序证实RNAi 慢病毒载体构建成功，病毒达到有效滴度，重组慢病毒Integrin β1 shRNA感染HEK 293T细胞和Sombati细胞癫痫模型后integrin β1蛋白表达下降。成功构建integrin β1 RNA干扰慢病毒载体，并在新生大鼠海马神经元和Sombati细胞癫痫模型中实现有效的基因沉默效应。目前正在进行siRNA沉默Integrin和/或Laminin基因后Integrin和/或Laminin基因和蛋白及其下游因子的研究，以进一步研究整合素-层粘连蛋白跨膜系统在难治性癫痫发病机理的作用。