酒类酒球菌降解糖苷产香关键葡萄糖苷酶基因确定及调控研究

β-glucosidase (βG) is the main glycosidase for Oenococcus oeni degrading glycosides and enhancing wine aroma during malolactic fermentation (MLF). βG is intracellular enzyme for most O.oeni strains, while intact cells of these stains also show high βG activity. O.oeni strains not only possess βG gene, but also several 6-P-βG genes. Intact cells of O.oeni strains possessing βG activity is of great importance for production, however, the mechanism of which is not clear. In this study, O.oeni SD-2a as research object, the key gene controlling the βG activity of SD-2a intact cells under wine conditions will be identified, through measuring expression of multiple glucosidase genes, intact cells enzyme activity and degradation of glycosides at different growth stages of SD-2a in medium, simulated wine and wine separately. Then the key control gene obtained will be verified by gene knockout technology under wine conditions, and expression of glucosidase encoded by the key control gene will also be studied by Western-Blot technique. Furthermore, regulation of key control gene and optimization of fermentation conditions will be conducted to improve the ability of O.oeni SD-2a to degrade glucosides during MLF. This study has important significance for wine quality improvement and further understanding biological mechanism of aroma enhancement during MLF.

β-葡萄糖苷酶是葡萄酒苹乳发酵中酒类酒球菌降解糖苷产香的主要糖苷酶。多数酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶为胞内酶，但其完整细胞也具有β-葡萄糖苷酶活；酒类酒球菌不仅有β-葡萄糖苷酶基因，还有多个6-P-β-葡萄糖苷酶基因。酒类酒球菌完整细胞具有β-葡萄糖苷酶活对实际生产意义重大，而其机理尚不明确。本项目以酒类酒球菌SD-2a为研究对象，分别测定其在培养基、模拟酒和葡萄酒中不同生长阶段多个葡萄糖苷酶基因表达量、完整细胞β-葡萄糖苷酶活和降解糖苷产香量，通过综合分析确定酿酒条件下SD-2a完整细胞β-葡萄糖苷酶活的关键控制基因；并通过基因敲除技术对所得关键控制基因进行验证；同时利用Western-Blot技术研究关键控制基因编码葡萄糖苷酶表达情况。在此基础上通过基因调控和发酵条件优化使关键酶大量表达，提高SD-2a降解糖苷产香能力。此研究对提高葡萄酒品质和进一步认识苹乳发酵中生物增香机制具有重要意义。

β-葡萄糖苷酶是葡萄酒苹乳发酵中酒类酒球菌降解糖苷产香的主要糖苷酶。多数酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶为胞内酶，但其完整细胞也具有β-葡萄糖苷酶活；酒类酒球菌不仅有β-葡萄糖苷酶基因，还有多个6-P-β-葡萄糖苷酶基因。酒类酒球菌完整细胞具有β-葡萄糖苷酶活对实际生产意义重大，而其机理尚不明确。本项目以酒类酒球菌SD-2a为研究对象，分别测定了其在培养基中不同碳源（葡萄糖、纤维二糖、熊果苷）诱导下不同部位β-葡萄糖苷酶活和6-P-β-葡萄糖苷酶活，同时测定了其在不同碳源诱导下不同糖苷酶基因（OEOE-1569、OEOE-1210、OEOE-0224）的表达量。通过对比不同糖苷酶活与不同糖苷酶基因表达量的变化，得出酒类酒球菌SD-2a完整细胞具有β-葡萄糖苷酶活的关键酶是6-P-β-葡萄糖苷酶，关键基因为OEOE-0224。同时测定酒类酒球菌Lalvin4X在不同碳源下不同糖苷酶活和不同糖苷酶基因表达量，通过对比分析糖苷酶活和糖苷酶基因表达量变化关系，对所得酒类酒球菌SD-2a的关键酶和关键基因进行了验证。通过GC/MS测定了酒类酒球菌SD-2a在苹果酸乳酸发酵中降解糖苷产生香气物质的种类和含量。SD-2a在苹果酸乳酸发酵中降解糖苷产生香气物质的种类为40种，最多的是萜类15种，其次是酯类10种、醇类8种、降异戊二烯4种，其他类香气物质3种，产生香气物质的总量为606.42μg/L，其中含量最高的为酯类261.7μg/L，其次是萜类218.45μg/L、醇类92.42μg/L、异戊二烯28.94μg/L，其他类香气物质4.91μg/L。萜类和酯类中的大部分物质具有花香和果香味，说明了SD-2a对增加葡萄酒香气具有很大的潜力。以产生香气的种类和含量为指标，通过单因素试验优化了酒类酒球菌SD-2a降解糖苷产生香气物质的条件。最佳条件为接种量6%，发酵温度19℃，发酵时间8天，pH3.6。此研究对改善葡萄酒风味，提高葡萄酒品质和进一步认识苹乳发酵中生物增香机制具有重要意义。