去泛素化酶USP4与酪氨酸磷酸酶PRL-3的相互作用及其在结直肠癌中的作用

We recently suggested that these were some functional links between Phosphatase of regenerating liver-3 (PRL-3), a key metastasis associated protein, and ubiquitin proteasome system（J Proteome Res，2011；Gut，2013）. Interestingly, Ubiquitin Specific Protease 4 (USP4), a deubiquitylating enzyme, was identified as a candidate of PRL-3 interacting protein by co-immunoprecipitation and mass spectrometry. More importantly, abnormal expression of USP4 contributes to the development and progression of CRC and PRL-3is indispensable for USP4-mediated oncogenic activity in CRC. USP4 interacted with and stabilized PRL-3 via deubiquitination, which resulted in activation of Akt and reduction of E-cadherin, critical regulators of growth and metastasis of cancer cells. Based on these results, we proposed a key functional crosstalk between USP4 and PRL-3 in colorectal cancer.We will study the functional link between USP4 and PRL-3 and their roles in pathogenesis and progression of CRC in intestinal specific knockout of USP4 mouse model, cell models and clinical samples of CRC.

近期我们发现，酪氨酸磷酸酶PRL-3可能存在与泛素／蛋白酶体系统之间的功能联系（J Proteome Res，2010；Gut，2013）。免疫共沉淀结合蛋白质谱分析结果表明，去泛素化酶USP4可能是PRL-3新型相互作用蛋白；并且USP4可以通过将PRL-3去泛素化而稳定PRL-3的功能，这是USP4促进上皮间质转化和结直肠癌转移的重要分子基础；同时，PRL-3对USP4也存在一定的影响。基于此我们提出，去泛素化酶USP4与酪氨酸磷酸酶PRL-3之间的相互作用构成一种重要的调节机制，并参与结直肠癌发生或转移的过程。本研究拟应用肠粘膜上皮条件性USP4敲除小鼠、结直肠癌相关细胞系及结直肠癌临床组织标本从整体动物模型、细胞模型及临床标本等方面明确去泛素化酶USP4与酪氨酸磷酸酶PRL-3的相互作用及其调节机制，并探讨它们在结直肠癌发生及发展中的作用。

酪氨酸磷酸酶PRL-3是一种结直肠癌转移相关基因，我们发现它与泛素／蛋白酶体系统之间的功能联系。去泛素化酶USP4在人结直肠癌组织中高表达，且与肿瘤大小、分化程度及远处转移相关; 稳定敲低USP4抑制结直肠癌细胞体外增殖、迁移、侵袭能力；裸鼠尾静脉注射结直肠癌细胞构建肺转移模型结果显示，稳定干扰USP4后的结直肠癌细胞SW480较对照组裸鼠肺转移肿瘤个数显著下降。USP4可以激活依赖PRL-3的AKT信号通路以及上调上皮性标记物E-cadherin的表达;USP4可以在蛋白水平上调控PRL-3表达; USP4去泛素化PRL-3且与PRL-3存在直接相互作用,外源性过表达USP4与PRL-3后，通过免疫共沉淀检测两者存在外源性相互作用。提取结直肠癌细胞SW480细胞，通过免疫共沉淀进一步验证两者存在内源性的相互作用。结直肠癌细胞SW480应用细胞免疫荧光实验结果显示USP4与PRL-3在结直肠癌细胞中均定位于胞浆。在HEK293T细胞中过表达PRL-3与HA-ubiquitin基础上瞬时过表达或干扰USP4，经过蛋白酶体抑制剂MG132处理后，免疫共沉淀实验结果显示USP4可以去泛素化PRL-3。进一步的结果发现，PRL-3参与USP4对结直肠癌细胞体外生物学特性的影响; 在结直肠癌细胞系与临床结直肠癌组织中USP4与PRL-3在蛋白水平上存在相关性。.为了进一步明确USP4的功能，我们建立了 USP4基因完全敲除小鼠和条件性敲除小鼠。USP4基因完全敲除小鼠杂合子皮下瘤种植实验显示，两组小鼠皮下瘤体积大小无明显差异，各脏器未发现肿瘤转移灶。 USP4基因完全敲除小鼠杂合子B16肺转移模型肺、肝脏组织切片HE染色分析，镜下可见结节状或弥散状肿瘤转移灶形成，转移灶大小无明显差异。USP4基因敲出小鼠肝脏炎症细胞因子IL-6mRNA无明显差异，TNF-a及IL-12存在一定的上调但统计学没有明显差异。USP4基因敲出小鼠结直肠炎症细胞因子，与对照组相比较，USP4敲出小鼠IL-6、TNF-a及IL-12mRNA没有明显差异。.与USP4去泛素化相对应, 我们还对几个泛素系统的成员Ube2v1和TRAF6进行了研究。