禽流感病毒NS1效应区EALQR基序调控病毒感染与宿主应答的分子基础

Too strong virulence or abundant immune responses are harmful to the both sides during the battle between the virus and the host immune system. It has been reported that there are a number of various ways to reach a commensal status. Our previous study indicated that an H5N1 avian influenza virus isolated from swine in the field with a naturally-deleted EALQR motif in its non-structural protein 1 (NS1) effector domain is attenuated to SPF chickens and could replicate well in the chickens without any clinical symptoms.However, the scientific question is that the pathogenesis in animals or cells is not fully investigated yet. Our current project aims to reveal a new mechanism by how the naturally-deleted NS1 without EALQR motif affects virus replication, host gene transcription and translation and innate signaling pathway, resulting in the virulent attenuation. Using the techniques of biochemistry or structure biology, etc, we would anticipate elucidating the naturally-deleted NS1 weakens the TRIM25-mediated RIG-I ubiquitination and RIG-I recognizing and binding to double-stranded RNA by destorying TRIM25 oligomerization and NS1 dimerization, further impairing the inhibition of activation of RIG-I signaling pathway and IFN production. Meanwhile, based on the reverse genetic system of influenza virus and the CRISPR-Cas9 technology, we will confirm the functions of EALQR motif at the live influenza virus level and physiological condition by infecting key gene-knockout (such as RIG-I-/-, TRIM25-/-) cells or mice with different rescued viruses. Our expected data will uncover the molecular basis of virus-host commensalism via decreasing the blockade of host antiviral responses, and provide the support for the development of attenuated vaccines and small molecular drugs against influenza viruses.

病毒与宿主在相互博弈过程中，病毒毒力过强或宿主过度免疫反应均不利于两者自身生存。两者共生的调控机制多种多样。前期研究表明H5N1禽流感病毒因其NS1蛋白效应区自然缺失EALQR基序而致毒力减弱，可以和宿主共生，但系统性的致病机制研究不足。针对该基序影响病毒致病表型的现象，拟从其调控病毒复制、基因转录翻译以及免疫信号通路等病毒与宿主相互作用层面入手，利用生化实验和结构生物学等技术手段，通过确定该基序影响NS1二聚体结构和TRIM25寡聚化，进而减弱RNA结合能力及TRIM25介导的RIG-I泛素化，同时利用拯救的重组病毒感染关键基因敲除的细胞或小鼠，在病毒水平和生理状态下验证该基序的生物学效应，初步阐明该基序调控病毒复制和宿主免疫应答的分子基础。本研究成果将揭示病毒为了生存而降低对宿主的致病力，从而达到和宿主共生的调控机制，同时为研发流感减毒疫苗以及小分子药物奠定理论基础。

A型流感病毒(Influenza A virus, IAV)感染宿主细胞过程中，一方面，宿主通过模式识别受体感知流感病毒入侵，启动I型干扰素(Type I interferon, IFN-I)信号级联反应，产生抗病毒效应；另一方面，流感病毒通过多种策略逃逸宿主免疫应答，以利于病毒生存。现有研究对流感病毒蛋白调控IFN-I信号通路的分子机制有一定揭示，但IAV在与宿主相互斗争过程中会不断变异出现更多应对宿主天然免疫的调控方式。因此，对流感病毒蛋白调控IFN-I信号通路的作用机制进行持续研究十分必要。前期研究表明H5N1禽流感病毒因其NS1蛋白效应区自然缺失EALQR基序而致毒力减弱，可以和宿主共生，但系统性的致病机制研究不足。.为了研究该基序是否调控IFN-I通路，我们首先在哺乳动物细胞中，利用双荧光素酶报告基因试验，定量PCR和免疫印迹试验发现，NS1Δ蛋白对IFN-β启动子活性、抗病毒因子转录水平、TBK1/IRF3/IκBα磷酸化和IRF3二聚化的抑制作用减弱。其次，通过rSX06-NS1和rSX06-NS1Δ两株重组病毒感染BALB/c小鼠发现，rSX06-NS1Δ在小鼠体内的复制能力低于rSX06-NS1，引起肺组织病理变化较轻微。根据NS1蛋白结构分析和二聚化试验发现，缺失EALQR基序扰乱NS1蛋白二聚体的稳定性进而影响其抑制功能，并且EALQR基序是最小功能单元。最后，我们通过RNA Pulldown和泛素化试验发现：NS1Δ蛋白与RIG-I竞争结合双链RNA的能力降低；NS1Δ蛋白对TRIM25二聚化和自身泛素化的抑制作用减弱，进而增强TRIM25对RIG-I泛素化修饰。本研究阐明IAV通过缺失NS1蛋白EALQR基序上调宿主免疫应答，降低病毒致病力，从而达到与宿主共生的目的。.IAV进化过程中，其它病毒蛋白也参与拮抗宿主抗病毒效应。本项目研究发现H7N9流感病毒PB1蛋白具有通过自噬溶酶体途径降解MAVS抑制天然免疫反应的功能；H7N9流感病毒核蛋白NP可在蛋白水平正调控I型干扰素信号通路；H5N1流感病毒HN109毒株NS1蛋白C端缺失113个氨基酸后，抑制干扰素和细胞凋亡的能力减弱，导致病毒复制能力减弱。.综上所述，本项目解析了NS1、PB1、NP等IAV蛋白调控宿主免疫应答的分子基础，为研发流感减毒疫苗以及小分子药物奠定理论基础。