酿酒酵母多重耐受性的改造策略及协同调控机制研究

This project is based on the practical needs of multi-stress tolerant microbes in the current fermentation industry. The current multi-stress tolerance modification is performed by using laboratory model microbes based on response to a single environmental factor, so it is difficult to obtain industrial strains which can response to multi-stress in real fermentation conditions. In this project, the industrial Saccharomyces cerevisiae capable of producing ethanol fuel from maize is selected as the object, based on genome editing technique CRISPR / Cas9, the full genome design of any multi-site editing strategy in combination with industrial fermented feeding and multiple pressure screening will be explored to establish a rapid evolutionary strategy to obtain an industrial Saccharomyces cerevisiae strain bearing multi-stress tolerance to the multiple pressure in real fermentation conditions. Furthermore, synergistic manipulation mechanism for the multi-stress tolerance will be investigated to provide theoretical and technological guidance for the multi-stress tolerance modification of industrial microbes.

项目从发酵工业对微生物多重耐受性的实质性需求出发，针对现有微生物耐受性改造方法多以实验室模式菌株为主、传统驯化方法耗时低效、驯化条件单一等问题，拟以玉米燃料乙醇工业酿酒酵母为研究对象，基于新一代CRISPR/Cas9基因组编辑技术，利用合成生物学方法设计全基因组任意多重位点编辑新技术，并耦合工业发酵微环境多重胁迫压力，研究工业酿酒酵母的快速进化方法，以期获得具有抵抗多种环境胁迫（高糖、高温、高乙醇浓度）的耐受性工业酿酒酵母，并初步探索酵母多重耐受性的协同调控机制，为工业微生物的多重耐受性改造提供理论依据和技术指导。

项目针对玉米燃料乙醇发酵工业中高糖、高温、乙醇毒害等发酵微环境胁迫因子，借助环境诱导适应性进化在微生物抗逆性改造方面的优势和CRISPR/Cas9系统助推基因组快速编辑的巨大潜力，依据现有燃料乙醇发酵工艺及CRISPR/Cas9系统的作用机制，探索将CRISPR/Cas9基因组编辑技术耦合多重压力筛选运用到工业微生物耐受性进化改造中，主要从三个方面开展研究工作:. 首先，全基因组任意多重位点编辑技术的设计与构建，完成了利用NCBI、SGD、YPA等数据库对酿酒酵母基因组数据分析，并针对酿酒酵母基因组与抗逆相关的功能基因和调控元件设计了三个sgRNA文库，通过过表达DNA ligase IV酶、敲出RAD52基因，将酿酒酵母的基因修复方式由以同源重组变为非同源末端修复方式，为实现酿酒酵母基因组任意位点引入突变、缺失进而实现基因组进化奠定基础；其次，耦合发酵微环境多重耐受性菌株的筛选方法研究，构建了可进行负筛选质粒缺失的Cas9蛋白酿酒酵母表达体系，采用生产线工艺水和清液配制高渗高抗的培养基，再经sgRNA文库引导基因组编辑，在高温高渗的条件下培养筛选基因组突变的酿酒酵母菌株，目前已筛选获得能在35℃在工业物料中进行正常发酵的工业酿酒酵母菌株；最后，多重耐受性酿酒酵母协同调控机制的研究，对筛选获得的突变菌种进行了组学分析，获得了突变菌种在工业物料下的基因组序列变化及转录水平差异的相关性数据。. 本项目技术的开发首先聚焦在发酵工业提升企业生产力的核心问题—提升微生物在特定发酵体系下的多重耐受性及发酵性能，该技术开发和推广可切实为发酵企业快速获得高产、高效、高耐受性的工业发酵菌株，并打破传统工业菌株开发驯化的漫长流程，尤其对于目前发酵行业已有成熟产业及发酵工艺的生产菌株的快速改造具有很强的推广应用性。