瓜类褪绿黄化病毒CP/CPm与介体烟粉虱蛋白互作机理研究

Transmission of plant viruses by insect vectors results from mutual recognition and interaction between virus particles and their vectors. Specificity and efficiency of plant virus transmission depend largely on protein-protein interactions of viruses and vectors. Cucurbit chlorotic yellows virus (CCYV), a newly reported semipersistent virus transmitted specifically by Bemisia tabaci, has caused serious damage on cucurbit and vegetable crops in many Asian countries. However, researches on CCYV transmission mechanisms have just got started in recent years, and especially studies on interactions of virus coat proteins and vector receptor proteins are still lacking. Based on the previous research results on CCYV transmission, the present project, by using techniques of immunology, yeast two-hybrid, laser scanning confocal microscope and membrane feeding, is proposed to elucidate the binding mechanism of CCYV virons with its whitefly vector, B. tabaci. The experiments in the project include binding function verification of CCYV coat protein (CP) and minor coat protein (CPm), screening and function determining of receptor proteins in B. tabaci. The results of the proposed project will hopefully provide experimental evidences for transmission mechanisms of semipersistent plant viruses, help to deepen our understanding of virus-vector interactions, and may lay the basis for development of new technologies and new strategies for effective control of plant virus transmissions.

昆虫介体传播植物病毒的过程是病毒粒体与介体相互识别、相互作用的结果，而病毒与介体的蛋白互作决定着介体传毒的特异性和传播效果。烟粉虱Bemisia tabaci半持久性传播的瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV），是一种新的瓜菜类病毒，在我国和亚洲许多国家造成严重危害，但其传播机理的研究刚刚起步，病毒外壳蛋白与介体受体蛋白互作机理的研究尚属空白。本申请项目在前期研究的基础上，利用免疫学、酵母双杂交、激光共聚焦显微镜、膜饲喂技术等研究CCYV与介体烟粉虱的结合机理，内容包括：CCYV病毒外壳蛋白（CP）和次要外壳蛋白（CPm）在病毒与介体结合中的功能，介体烟粉虱受体蛋白的筛选及功能验证等。本项目的研究结果将提供半持久病毒传播机理的实验例证，有助于加深对植物病毒-介体昆虫互作的认识，同时或将为研发控制介体传毒的新技术和新措施奠定基础。

烟粉虱Bemisia tabaci半持久性传播的瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV）在我国和世界许多国家造成瓜类作物的严重危害，亟需研究其传播机理从而有效控制该病毒，而蛋白互作是病毒传播的核心问题。目前，CCYV病毒外壳蛋白与介体受体蛋白互作机理的研究尚属空白。本项目以蛋白互作为切入点，研究CCYV 在介体烟粉虱体内的结合机理：（1）首先克隆和表达CCYV病毒外壳蛋白（CP）和次要外壳蛋白（CPm），确定CCYV的结合蛋白。（2）利用已经确定的CCYV结合蛋白CPm，筛选并确定介体烟粉虱结合蛋白。. 项目取得了预期研究结果，第一，通过蛋白互作和免疫荧光技术，确定了CCYV 的结合蛋白是CPm，而不是CP，并验证了其结合功能；第二，采用转录组对比分析、通过DUALmembrane系统酵母双杂交实验从烟粉虱cDNA文库中筛选CPm互作蛋白，结合胶内酶解和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析技术，对胶条样品中的蛋白混合物进行分析，多肽的鉴定通过与烟粉虱数据库进行比对，最后通过多种功能验证方法，最终确定与CCYV CPm结合的烟粉虱受体蛋白确定烟粉虱的COX (Cytochrome c oxidase subunit 5A，细胞色素c氧化酶亚基5A), TUB (Tubulin beta chain，微管蛋白β链)和KRT (Keratin, type I cytoskeletal 9-like，角蛋白I型细胞骨架9)，具有介体受体蛋白性质，这些蛋白在烟粉虱传播CCYV病毒中发挥重要作用。本项目的研究结果有助于加深对植物病毒-介体昆虫互作关系的认识，将从蛋白互作方面为半持久病毒传播机理研究提供的的实验例证，同时将为研发基于蛋白互作的控制介体传毒的新技术和新措施奠定基础。