寡糖的高效分离纯化研究

寡糖在自然界广泛存在，在生命科学中起到重要作用，具有多种生物学活性。本课题针对寡糖研究中高效分离纯化的难点问题，以亲水色谱作为分离手段，发展新型亲水色谱分离材料，提高材料的亲水性和对于寡糖分离的选择性；以酸性、中性、碱性和硫酸化的代表性寡糖对亲水色谱分离材料进行评价，建立和优化寡糖的亲水色谱分析方法；建立寡糖亲水色谱分离分析从分析水平到纯化制备的放大方法，进行酶解来源均寡糖的纯化分离，获得聚合度不同的单一寡糖；对单一寡糖进行质谱和核磁的结构表征，获得寡糖结构表征的质谱和核磁规律；集成寡糖分析、高效分离纯化、结构表征的成套方法，以天然寡糖的高效分离纯化作为应用示范，获得新型结构的单一寡糖，解析天然寡糖的组成和结构。

寡糖在自然界广泛存在，在生命科学中起到重要作用，具有多种生物学活性。本课题针对寡糖研究中高效分离纯化的难点问题，以亲水色谱作为分离手段，发展新型亲水色谱分离材料（酒石酸酰胺固定相和二氨基固定相），目的是提高材料的亲水性和选择性，表征结果显示，两种固定相有较好的亲水性，可用于糖类化合的分离；以三种单糖和七种二糖为探针，建立亲水色谱分离材料评价体系，系统考察了柱温、缓冲盐、pH和固定相表面修饰官能团对糖分离的影响。结果表明，柱温会影响糖类化合物的保留时间、峰形和差向异构现象；HILIC方法的选择性由糖类化合物的结构（单糖组成和连接方式）和固定相的本质（官能团结构）所决定。不同色谱柱之间的互补选择性，将有助于具有相似结构的糖类化合物的分离；HILIC固定相的表面可以带有负电荷也可带有正电荷，这取决于固定相上的官能团、残留硅醇基以及流动相的pH值。对于分离离子型糖类化合物，可通过加入缓冲盐调节流动相的pH，减少离子型糖类化合物与固定相表面强的离子交换作用，从而避免拖尾。根据评价结果，最终确定了各类寡糖的HILIC分离方法；对天然来源寡糖（中药泽兰）建立了固相萃取 (SPE)-HILIC分离方法。采用亲水模式SPE方法，实现寡糖的分段富集，然后采用HILIC方法高效制备，获得聚合度不同的单一寡糖（DP4-7）；对天然来源的多糖，以黄芪多糖为研究对象，建立了部份酸解-亲水色谱分离方法。考察水解时间、酸浓度和温度对多糖水解程度的影响，经水解后，黄芪多糖降解为特征性的寡糖片段，再用HILIC-MS分别在负、正离子模式下对黄芪水解物的结构进行表征。结果表明，提取得到的黄芪多糖为1-4连接葡聚糖，水解后，得到DP 4-11的葡寡糖。以甜叶菊中的糖苷类化合物为研究对象，建立固相萃取-亲水色谱-反相色谱二维液相色谱方法。使用SPE实现糖苷类化合物富集，再用反相/亲水二维分离体系进行分离纯化，得到高纯度单体化合物11个。课题建立了集成色谱评价、高效分离纯化和结构表征的成套方法，以天然来源糖类化合物的高效分离纯化作为应用示范，为深入研究寡糖提供分离手段。