山羊胚胎着床和胎盘形成中相关基因筛选鉴定及Tagln2 作用机制研究

Mammalian embryo implantation is critical to establish pregnancy. Though a lot of progress had achieved on embryo implantation, a number of key genes had been identified, the mechanism remains unclear. Tagln2 is cytoskeletal protein associated with actin, which involved in cell proliferation and differentiation. We had found in our previous studies that Tagln2 involved in implantation of mice and rabbits, but the molecule mechanism in ruminants had not been reported. In this study, we use immunofluorescence, Western blot, in suit hybridization and Real-time PCR to focus on expression of Tagln2 in uterus of goats in peri-implantation and estrous cycle, and gland knockout models and intrauterine infusions of IFN-τ are used to study the regulation of Tagln2 in vitro. Culture primary goat uterine epithelial cells to work out the impact of estrogen, progesterone, INF-τ, PGs, CSH1 on Tagln2. We also use RNA interference to downregulate the expression of Tagln2 to observe the changes in proliferation and differentiation of goat uterine epithelial cells, reveal the role of Tagln2 in the establish of uterus reception. In addition, microarray are also applied screening implantation-related genes in uterine cavity glandular and luminal epithelium of white goat on the first 16 day of pregnancy, select parts of the genes conduct verification and functional studies.This study will provide theoretical basis and experiment ideas for improving and optimizing technical links of embryo transfer, selecting receptors with strong ability to conceive, improving the embryo culture conditions and the survival rate of embryo in vivo and in vitro, etc.

反刍动物胚胎着床和胎盘形成机制目前不清楚。Tagln2是actin相关的细胞骨架蛋白，我们以前的研究发现Tagln2参与小鼠和兔子的胚胎着床，在反刍动物中该分子目前没有报导。本研究利用免疫荧光、Western blot、原位杂交、Real-time PCR研究Tagln2在围着床期和发情周期山羊子宫中表达，利用腺体敲除模型和子宫灌注INFτ在体研究Tagln2的调节因素。体外培养原代山羊子宫上皮细胞，研究雌激素、孕酮、INFτ、PGs、胎盘催乳素对Tagln2的影响。通过RNA干涉实验研究Tagln2表达下调后，羊子宫上皮细胞的增殖和分化的变化，研究Tagln2在山羊子宫内膜可接受态建立中的作用。此外，还将应用基因芯片的方法筛选白山羊妊娠第16天子宫腺上皮和腔上皮中着床相关基因，选择部分基因进行验证和功能研究。本研究将为改进和优化胚胎移植技术，改善胚胎培养条件，提高动物繁殖力提供理论。

胚胎着床是同步发育的子宫和胚胎之间的精确相互作用，是妊娠建立的关键。山羊是经济动物，由于具有反刍动物胚胎表面着床的特点，也是研究胚胎与子宫粘附的良好模型。山羊胚胎着床的研究即可以补充哺乳动物胚胎着床机制研究的理论问题，又具有改善胚胎工程技术效率的实际意义。本课题建立了观察山羊胚胎着床的体内模型，研究了调宁超家族蛋白成员2（Tagln2）在山羊胚胎着床过程中的作用机制。研究发现Tagln2主要存在于山羊子宫的腔上皮和腺上皮；在发情周期的子宫中呈周期性变化，在黄体期表达量升高，受孕酮的上调；Tagln2在母胎界面高表达；受INF-T的影响不明显；Tagln2参与山羊子宫上皮的生理功能，在胎盘形成早期发挥作用。应用转录组测序的方法分析山羊胚胎粘附前（D6）、粘附中（D16）、和完成粘附（D19）三个时期的山羊子宫转录本差异，从中选择粘附相关分子整合素的亚单位ITGB1、ITGAV、ITGB3、ITGA5、Wnt受体FZD5以及结缔组织生长因子（CTGF）、解偶联蛋白2（UCP2），深入研究这些基因在山羊子宫中的表达与调节。转录组测序的子宫样本同时做了MicroRNA测序工作，转录组测序和MicroRNA测序联合分析，为进一步开展山羊胚胎着床的研究工作提供实验数据。由于羊不是模式动物，存在动物取材的周期较长、难度大、个体差异较大、细胞培养易污染、针对羊的实验手段需要优化等一系列问题。本课题研究为开展山羊胚胎着床研究工作完善了试验方法，积累了实验数据，取得了一批研究成果。关于羊的胚胎着床研究工作在国内报道较少，我们的研究工作填补了这个研究方向的不足。