鹿茸多肽复合BMP-2、IGF-1双基因纳米载体治疗骨缺损的实验研究

应用基因治疗技术治疗骨缺损是目前研究的热点。其中聚合物基因载体因其生物相容性好，降解产物无不良反应等优点而更受青睐。而纳米载体应用于中药制剂的研发，不仅有助于中药剂型的改良，也有利于中药疗效的提高。.鹿茸多肽作为中药提取物含有多种生长因子，能明显加速实验性骨折大鼠骨痂形成，缩短骨折愈合时间。骨形态发生蛋白能在体内、外诱导骨髓MSCs和骨祖细胞分化为成骨细胞和软骨细胞而诱导新骨形成。IGF-1可介导生长激素对骨骼的刺激效应，促进膜内成骨修复骨缺损。但实验也发现，双基因表达载体的作用有限，随时间推移成骨能力逐渐减弱。而通过纳米技术可延长药物作用时间，提高稳定性及生物利用度，且毒副作用低。故拟将鹿茸多肽作为基因递送载体，同含有BMP-2和IGF-1基因的重组质粒结合，观察其对于BMSCs向成骨细胞转化进行研究，以充分发挥其药用价值及可作为基因载体的双重特性，构建中药纳米基因转染平台。

应用基因治疗技术治疗骨缺损是目前研究的热点。鹿茸多肽作为中药提取物含有多种生长因子，能明显加速实验性骨折大鼠骨痂形成，缩短骨折愈合时间。骨形态发生蛋白能在体内、外诱导骨髓MSCs和骨祖细胞分化为成骨细胞和软骨细胞而诱导新骨形成。IGF-1可介导生长激素对骨骼的刺激效应，促进膜内成骨修复骨缺损。故拟将鹿茸多肽作为基因递送载体，同含有BMP-2和IGF-1基因的重组质粒结合，观察其对于BMSCs向成骨细胞转化进行研究，以充分发挥其药用价值及可作为基因载体的双重特性，构建中药纳米基因转染平台。 . 本研究主要探讨将鹿茸多肽作为基因载体，与含有BMP-2和IGF-1基因的重组质粒结合，观察其对于BMSCs向成骨细胞转化进行研究，以充分发挥其药用价值及可作为基因载体的双重特性，构建中药纳米基因转染平台。实验结果显示，骨髓间充质干细胞生长情况，检测细胞增长和存活情况，和细胞碱性磷酸酶（ALP）阳性率及钙化结节。结果在显微镜下可见大鼠骨髓间充质干细胞形成集落并持续扩增，细胞接近汇合时有80%的细胞有阳性表达，融合后能够形成钙化。利用基因工程技术分别构建了pEGFP-N1/IGF1、pEGFP-N1/BMP2单基因表达重组质粒和pEGFP-N1/IGF1-BMP2双基因共表达重组质粒，经限制性核酸内切酶酶切鉴定证实上述重组质粒构建正确。通过对新鲜鹿茸分离纯化出鹿茸多肽。鹿茸多肽与双基因共表达质粒结合后转染大鼠骨髓基质干细胞，荧光显微镜观察细胞转染情况，采用改良Gomori钙钴法计数细胞碱性磷酸酶（ALP）阳性率及钙化结节。试验结果表明在48小时后，转染细胞呈阳性表达，pEGFP-N1/IGF1-BMP2转染效率最高。ALP阳性表达，并有钙化结节形成。表明转染后大鼠BMSCs在体外培养环境中具有成骨能力。. 综上所述，表明构建的pEGFP-N1/IGF1-BMP2真核细胞表达载体质粒与鹿茸多肽结合能够顺利以阳离子脂质体的方法转染到BMSC中，使外源性BMP-2，IGF-1基因稳定表达。IGF-1，BMP-2联合基因修饰的BMSC可向成骨细胞定向分化。本实验建立的在体外基因转染的方法，为骨组织工程种子细胞的改良提供了实验依据。