通用型核糖开关式基因表达调控系统的构建及相关机制的研究

It's the encountered difficulties that how to achieve the purpose of precise regulation of gene expression at the expression time and expression level in the current gene therapy process. This project plan to select the exogenous small molecules tetracycline as an inducer molecule, through studying the tetracycline-specific RNA aptamer structure and the regulatory mechanism of the target gene expression caused by the RNA conformational changes in the eukaryotic cell, then design the core sequences and connected components of the tetracycline sensitive riboswitches (tet-riboswitch); using the recombinant adeno-associated virus (rAAV) as vector, and the enhanced green fluorescent protein (EGFP) as reporter gene, set up an mammalian cells (Hela cells) gene expressed model, then using the flow cytometry-based cell screening technology to select a efficiency, low toxicity, rapid induce and deinduce riboswitch gene expression control system. Basing on studying the run mechanism, efficiency, response time and dote-dependent of the riboswitch system, this project plan to build a plug and play universal riboswitch gene expression control system. If the feasibility of this riboswitch gene expression control system were verified, it will has an important significance for the gene therapy of diabetes, cancer, cardiovascular, nervous system and other major diseases.

如何实现目的基因表达时间和表达水平的精确调控是当前基因治疗过程中遇到的主要难点。本项目拟通过选用外源小分子四环素（Tet）作为诱导分子，通过研究四环素敏感的RNA适体与真核细胞RNA构象变化对基因表达的调控机制，设计四环素敏感的核糖开关核心元件和连接序列；以重组腺相关病毒（rAAV）为载体，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因建立哺乳动物细胞（hela细胞）表达模型，利用基于流式细胞仪的细胞筛选技术筛选高效、低毒、诱导和去诱导过程快速的核糖开关式基因表达调控系统。研究筛选出的核糖开关式调控系统的作用机制与工作效率、诱导响应时间和剂量依赖性，并在此基础上构建可即插即用的通用型基因表达调控系统。本项目研究如能验证此核糖开关式基因表达调控系统的可行性，将对糖尿病、肿瘤、心血管、神经系统等重大疾病的基因治疗研究具有重要意义。

为了解决基因治疗中靶基因快速和高效调控的问题，我们将核糖开关调控靶基因的机制移入在哺乳动物细胞中并研究其作用机制，并对核糖开关各元件进行优化，进一步改善和提高靶基因调控效率。 经查阅文献及利用生物信息学和分子生物学工具，我们对四环素敏感型核糖开关进行设计和优化，并采用最后采用基于适体局部保护的方法检测适体构象与配体结合效率的关系，最后构建四环素和茶碱敏感型核糖开关载体，并基于此建立Hela细胞靶基因表达模型，进行核糖开关调控效果验证，发现核糖开关在哺乳动物细胞可以调控靶基因表达。.在发现核糖开关可以在哺乳动物细胞中进行靶基因调控表达后，经过调控效果对比分析，研究对象转为茶碱敏感型核酶调控机制的核糖开关。 利用点突变PCR技术对特定配体核糖开关适体区域筛选方法进行了研究，引入并利用链置换机制和对茶碱和四环素响应型核糖开关进行了优化，优化了适体筛选流程，使适体筛选从一条序列而不是一个序列库开始，提高了筛选效率。经过筛选，新构建的四个核糖开关调控目的基因表达量分别增加了1.5, 1.3, 1.4, 1.7倍。.另外在系统考虑哺乳动物细胞内基因表达的主要过程基础上，我们以核酶式核糖开关主要构象间的转换为核心，构建了基于核糖开关不同构象间能级差分析靶基因调控效率的数学模型，提出核糖开关主要构象间自由能变化是基因基础表达量的决定性因素的假设，并将之用于指导核糖开关的设计和优化。作为核糖开关评价体系一部分，我们还研究了利用相关生物传感器检测反应系中氢离子浓度的微小变化来实现对靶DNA和RNA进行检测，进而研究对利用生物传感器对核糖开关调控型表达系统进行快速评价的方法。在数学模型指导下，新设计的核酶核糖开关在Hela细胞中呈现出明显的正调控性能，在1000 μM茶碱浓度下，海肾萤光素酶报告基因的表达水平增加90%，与已有的同类型核酶核糖开关相比，基础表达量降低了2/3。新设计的核酶核糖开关性能有明显的提高。.. 我们采用不同载体和靶基因，均发现本项目构建核糖开关可在哺乳动物细胞中调控靶基因表达。经过对其中机制研究，通过优化设计可改善核糖开关对靶基因表达调控的效率。但由于哺乳动物细胞本身复杂性，要获得理想的核糖开关调控元件，还需要做进一步研究。