基于高通量测序技术的贵州蝙蝠免疫组库分析

Bats are the most important natural reservoir for human pathogenic viruses, virtually little information is available on bat virus species and the mode of transmission. Despite the diversity of virulent viruses carried by bats are pathogenic to most mammals, but appear to cause no clinical disease in bats during natural or experimental infection, indicate that the nature of protective immunity in bats differs from other mammals. In this project Rousettus leschenaultia, Myotis daVidii, Rhinolophus ferrumequinum, and Megaderma lyra from Guizhou province will be selected for TCR&BCR germ-line reannotation and detect the composite and characteristcs of CDR3 repertoires based on the established techniques for sequencing and analyzing T&B cell CDR3 repertoires by high-throughput sequencing, and combine with the results of bats viral metagenomic analyse, the diversity and clonality of TCR&BCR CDR3 repertoires and their relationship with the species and abundance of viruses carried by bats will be analyzed. This study will provide the basic data for the adaptive immunity in bats and reveal the functions of T/B cells against the species and abundance of viruses, and will provide a new way and technology for human to against and treatment in virulent or emerging viruses.

蝙蝠是最重要的人类感染病毒储存库，但其携带病毒的种类、机制、传播方式等均未得到完全阐明，因其能长期携带烈性病毒，提示蝙蝠存在与人和小鼠等哺乳动物不同的抗病毒机制。本项目拟选取贵州地区代表的棕果蝠、大卫鼠耳蝠、马铁菊头蝠以及印度假吸血蝠为研究对象，应用本实验室前期建立的高通量测序T&B细胞CDR3组库的技术和分析平台，重注释蝙蝠TCR&BCR胚系基因，深度解析其T&B细胞CDR3组库的构成和典型特征。同时结合蝙蝠病毒宏基因组测序，对比分析蝙蝠T&B细胞CDR3组库多样性、克隆性等组成与其携带病毒种类和数量之间的可能关系。项目将为蝙蝠T&B细胞适应性应答在其所携带病毒的种属及丰度中的作用研究提供基础，同时为人类抵抗烈性或新型病毒的感染和治疗研究提供新的研究思路和技术手段。

蝙蝠是最重要的人类易感病毒储存库，因其能长期携带烈性病毒，提示蝙蝠存在与人和小鼠等哺乳动物不同的抗病毒机制。适应性免疫是机体抗病毒的主要免疫系统，但由于适应性免疫系统的复杂组成和分析的困难，我们对蝙蝠适应性免疫系统的理解有限。蝙蝠的适应性免疫应答依靠其T&B细胞对抗原进行识别及应答，对抗原的识别由TCR&BCR完成，主要依靠TCR/BCR重链CDR3区进行特异性识别。本项目对3种蝙蝠（马铁菊头蝠、苍白矛吻蝠、伏翼）TCR/BCR重链胚系基因进行了详细注释。对于TCR ，我们共注释了174个V基因片段，分为30个家族；2个D基因家族；2个J基因家族。对于BCR，我们共注释了179个V基因片段，分为6个家族；16个D基因家族；7个J基因家族。我们将所有的胚系基因根据胚系基因结构信息区分了不同的结构域，并生成了参考数据库bat_tbcr.json，通过这个文件，借助Mixcr包可以实现蝙蝠抗体组库的高通量分析，在分析蝙蝠免疫组库构成方面有重要的应用。以此为模板，我们提出了未知胚系基因信息物种免疫组库分析流程：基因组测序-胚系基因注释-免疫组库分析，这种流程可用于分析尚未知晓胚系基因特征的物种的免疫组库。这种分析方法对于我们了解具有独特适应性免疫反应的物种、深入了解适应性免疫反应的进化都将有着重要的作用。进一步，本项目完成了中华菊头蝠、中菊头蝠、大蹄蝠三种蝙蝠TCR/BCR组库测序，利用参考数据库进行了TCR/BCR组库分析(多样性组成、克隆分布频率、CDR3长度分布及构成、V(D)J连接区插入和剪切（N/P）、V-J配对及特征、CDR3氨基酸取用分布)，并与人及小鼠TCR组库的特征进行比对。本项目首次高通量地解析了蝙蝠的免疫组库，其展现出高度多样性，提示蝙蝠适应性免疫系统可以识别种类庞大的抗原；其tcr cdr3特定位点氨基酸保守，说明其tcr识别存在MHC限制性；其rss序列保守，说明其t/b细胞受体重排机制与人及小鼠类似，是由酶介导的剪切及连接；其家族取用与人及小鼠存在差异，提示其免疫系统识别抗原与人及小鼠存在不同，这或许是其能够与病毒共存的原因。