半滑舌鳎膜孕激素受体（mPR-like)及其对卵母细胞成熟过程的作用

The membrane progestin receptors (mPRs) mediate nongenomic actions of progestin hormones to induce oocyte maturation in fish. Recently we discovered a previously uncharacterized receptor with the characteristics of mPRs in the ovary of the half-smooth tongue sole (cynoglossus semilaevis). Computer modeling predicts that the deduced mPR-like protein has seven-transmembrane domains. And phylogenetic analysis reveals that the mPR-like sequences from different teleosts cluster to form a distinctive clade and locate between mPRα subtype and mPRβ subtype. The mPR-like gene mRNA is abundant in the ovary of half-smooth tongue sole by RT-PCR analysis. Preliminary evidences provide clues that the novel mPR-like may play an important role in fish reproduction. In the present study we will explore the mechanisms of action of mPR-like gene in the female half-smooth tongue sole. Analysis of the mPR-like gene mRNA expression in the differential tissues and mPR-like gene cellular distribution will lay the foundation to reveal mPRs physiological function in teleost. Changes in mPR-like gene mRNA and protein abundance at various stages of oocyte development will be investigated. Hormonal regulation of mPR-like mRNA and protein expression at different stages of oogenesis will be examined, as well as the steroid binding and intracellular signaling pathways. Finally, the effects of inhibition of progestin induction of oocyte maturation upon microinjection of mPR-like gene antisense oligonucleotides will be examined. Those results will clarify the mPR-like gene molecular and cellular mechanism regulating oocyte maturation in the half-smooth tongue sole . And these relevant findings may provide new ideas to develop the novel and highly potent drugs for inducing fish ovulation.

孕激素通过膜孕激素受体（mPRs）的非基因作用诱导鱼类卵母细胞成熟。前期研究表明，半滑舌鳎卵巢有一个膜孕激素受体家族新成员（mPR-like），是一种具有7个跨膜区域的膜蛋白；系统发生分析认为，半滑舌鳎mPR-like位于mPRα和mPRβ分支之间，其mRNA在卵巢组织表达丰富，预示该受体可能在鱼类繁殖过程中发挥重要功能。本项目拟以半滑舌鳎mPR-like基因为研究对象，分析该基因在雌性半滑舌鳎不同组织的mRNA表达差异并进行细胞定位，为揭示膜孕激素受体（mPRs）在鱼类繁殖过程中的生理功能奠定基础；研究半滑舌鳎mPR-like基因在不同发育阶段卵巢滤泡的mRNA和蛋白表达量的变化及其对外源激素调控的响应、配体结合及信号传导特点和该基因敲降对卵母细胞成熟的影响，阐明mPR-like基因在半滑舌鳎卵母细胞成熟过程中的作用机制；相关研究成果可望为高效新型的鱼类催产剂的开发提供新思路。

孕激素通过膜孕激素受体（mPRs）在诱导鱼类卵母细胞成熟方面起到重要作用。前期研究表明，在半滑舌鳎卵巢发现一个膜孕激素受体家族新成员（mPR-like）,可能在鱼类繁殖过程发挥重要功能。随着mPR-like研究的深入，我们认为该受体在进化过程中来源于mPRα基因复制，进一步将其命名为PAQR7b。二级结构分析表明, PAQR7b蛋白存在 7 个跨膜区域； 三级结构分析表明该蛋白有多个结合位点。进化分析表明PAQR7b为mPRα 和mPRβ进化的中间类型，与其它鱼类PAQR蛋白具有较高的相似性； 另外，半滑舌鳎PAQR7b与鱼类mPRα的同源性更高，可能源于mPRα基因复制。并且PAQR7b的mRNA和蛋白表达在所有组织，包括卵巢。采用光学显微镜和透射电镜研究半滑舌鳎卵巢滤泡发育，依据卵黄发育状态和细胞器将卵巢滤泡分为5个发育阶段。原位杂交和免疫组化结果揭示PAQR7b分布在完全生长期的卵巢滤泡细胞的细胞膜附近，以及垂体内分散的细胞上。PAQR7b的mRNA在卵巢滤泡发育早期表达低，然后显著增加，在完全生长期达到最高表达水平。采用促性腺激素调控卵巢滤泡细胞，发现PAQR7b的mRNA和蛋白表达增加，其表达量增加具有使用的激素剂量和卵母细胞发育阶段依赖的特点。基因敲降结果表明PAQR7b参与诱导卵母细胞成熟。在繁殖周期的脑和卵巢组织，PAQR7b mRNA从卵巢发育II 到V期显著增加，并在V期达到最大值；而在卵巢发育Ⅵ期，PAQR7b mRNA迅速下降 。在繁殖周期垂体组织，PAQR7b 转录水平在V期达到峰值。放射免疫测定的结果表明半滑舌鳎雌鱼血清中孕酮激素的含量变化在整个繁殖周期中差异显著，在性腺发育IV期含量迅速升高并在V期达到峰值。本项目研究结果表明PAQR7b在半滑舌鳎卵母细胞成熟过程中具有重要作用，并且该受体可以通过下丘脑-垂体-性腺轴调控繁殖。这为半滑舌鳎卵母细胞成熟分子机制解析奠定了基础，同时也为高效新型鱼类催产剂的开发提供新思路。在项目执行过程中，选取另一种鲆鲽类-牙鲆也进行了PAQR7b相关研究，进一步验证了该基因功能。发现PAQR7b基因来源于硬骨鱼类mPRα基因复制后，也开展了mPRα在半滑舌鳎和牙鲆的生理功能的比较研究，丰富了膜孕激素受体家族基因理论成果。