联合互补蛋白组学技术的风湿性疾病痹证主要证型研究

本研究联合采用蛋白质组学研究中互补的两条技术路线：双向凝胶电泳（2-DE） 结合串联质谱技术以及先进的iTRAQ 标记的液质联用技术，对中医风湿性疾病痹证的主要证型寒湿痹阻证、湿热痹阻证进行血清差异蛋白质组学研究。通过与正常及同病异证之间的比较，以及三种风湿性疾病之间证相关蛋白的比较，寻找风湿性疾病寒湿痹阻证、湿热痹阻证的证相关蛋白群，以阐明辨证论治的科学性，为中医证本质研究及中医证候诊断的客观化奠定基础。

风湿性疾病痹证（类风湿关节炎、强直性脊柱炎、骨性关节炎、痛风）是慢性反复的临床常见病和多发病。中医药治疗风湿性疾病痹症重在辨证分型，而后依据证型对症治疗。借助于蛋白质组学技术，将血液中所有蛋白作为研究对象，结合临床辨证分型，寻找与证相关蛋白，这种研究思路符合中医整体观特点，符合证候研究自身特点，有利于从整体水平评价“证”实质。但目前国内外尚缺乏应用血清蛋白质组学技术进行风湿性疾病痹证证型研究报道。本课题将目前蛋白质组学研究中主要采取的两条技术手段：双向凝胶电泳（2-DE）结合质谱技术以及先进的iTRAQ 标记液质联用技术相联合，病与证相结合，开展风湿性疾病痹证主要证型（寒湿痹阻证和湿热痹阻证）血清差异蛋白质组学研究。结果：（1）9个类风湿关节炎寒湿痹阻证血清差异表达蛋白；5个强直性脊柱炎寒湿痹阻证血清差异表达蛋白。这些差异蛋白与寒湿痹阻证的物质代谢和病理过程有关，生物信息学分析提示寒湿痹阻证存在对细胞生长的调控事件，主要表现为细胞增殖、细胞分化等细胞事件的减弱与抑制。（2）应用 2-DE结合串联质谱技术发现9个类风湿关节炎湿热痹阻证血清差异表达蛋白；5个强直性脊柱炎湿热痹阻证血清差异表达蛋白。分析这些差异蛋白的功能，提示风湿性疾病湿热痹阻证存在细胞生长和增殖，细胞吞噬作用的增强；横纹肌细胞膜的稳定性受到影响以及脂质代谢紊乱等情况；以炎症免疫、细胞增殖等活动增强为主，也可能涉及补体激活通路的参与。（3）应用iTRAQ 标记的LC-MS/MS 技术发现6个类风湿关节炎湿热痹阻证血清差异表达蛋白；8个强直性脊柱炎湿热痹阻证血清差异表达蛋白。C反应蛋白是风湿性疾病（类风湿关节炎、强直性脊柱炎、痛风）湿热痹阻证所共有的证型差异蛋白。应用生物信息学技术分析这些差异蛋白的功能，提示风湿性疾病湿热痹阻证处于疾病急性期反应，存在强烈的炎症反应和炎症活动性，此外，存在细胞运动、细胞增殖以及细胞吞噬功能等增强，机体组织损伤以及骨质破坏的表现。通过血清差异蛋白组学2-DE结合质谱技术以及先进的iTRAQ 标记液质联用技术，我们在风湿性疾病（类风湿关节炎、强直性脊柱炎、骨性关节炎、痛风）的主要证型寒湿痹阻证和湿热痹阻证血清中成功发现并验证了一些证候相关蛋白质。本项目定量和鉴定的证候差异蛋白大部分为首次发现和报道，为进一步的研究奠定了基础。这些蛋白与证候的发生发展相关，可能成为证候分子标志物。