Vlgr1调控Cdh23表达的分子机制及其在Usher综合征发生中的作用研究

Deafness is the frequently disease in our country，accounting for 1/3 of the total number of patients with disabilities. Usher syndrome is a major cause of blindness and deafness, VLGR1 gene mutations causes 2C type Usher syndrome, but the exact mechanism is unclear. The project will be carried out detection VLGR1 mutations in Usher syndrome family, in order to explore the molecular pathogenesis of USH. Using scanning electron microscopy technology researches stereocilia bundle arrangement、development and ultrastructural in Vlgr1-/- mices and Vlgr1+/+ mices. While the impact of auditory brainstem response study of auditory function. This is clearly about Vlgr1 effects on stereocilia bundles for the development and maintenance. Detecting VLGR1 mutation influence of the location and expression of ankle connects compound protein in inner ear.While Vlgr1 regulats expression of Cdh23, Which key proteins stereocilia tip links.Thereby further clarify the mechanism of USH cause by VLGR1 gene mutations. It will be research mechanism the autohydrolysis of Vlgr1 from molecular level, and explore Vlgr1 receptor activation and regulation mechanism of biological processes.Results will provide theoretical basis to understand Usher Syndrome pathogenesis and establish the diagnosis and gene therapy.

我国目前有听力残障的患者占残疾人总数的1/3。Usher 综合征（Usher Syndrome，USH）是致聋和致盲的主要原因。VLGR1基因突变可导致USH2C的发生，致病机制尚不清楚。本研究将对Usher综合征家系进行VLGR1基因突变的检测,寻找VLGR1突变新的致病位点；通过扫描电镜技术观察正常及VLGR1突变小鼠静纤毛束发育和超微结构的情况，并结合听功能检测，从而明确VLGR1对静纤毛束发育、功能维持和听功能的作用；研究VLGR1突变对踝连接复合物蛋白在内耳中的定位及表达的影响；同时研究其编码的黏附G蛋白偶联受体Vlgr1对静纤毛顶端连接的关键蛋白Cdh23表达的调节机制,进一步明确VLGR1基因突变对USH2C发生发展中的作用。并从分子水平研究Vlgr1发生自水解的机制,探讨Vlgr1受体激活、调控的机制。本研究结果将为理解USH发病机理及寻找治疗靶点提供理论依据

我国目前有听力残障的患者占残疾人总数的1/3。Usher 综合征是致聋和致盲的主要原因。而VLGR1基因突变可导致USH2C综合征的发生，但致病机制尚不清楚。Vlgr1是目前已知的最大的一类G蛋白偶联型受体，其介导的信号通路参与多种生理过程。毛细胞顶部的静纤毛由一些不同类型的连接将它们联系在一起，这些细胞外连接在听纤毛发育、结构维持以及听觉传导中发挥十分重要的作用。Vlgr1 与Usherin，Vezatin 和Whirlin 共同形成踝连接复合物。我们的研究发现VLGR1 基因缺失对Usherin，Vezatin 和Whirlin的表达并没有影响，但不能形成踝连接。并发现在新生Vlgr1-/-小鼠耳蜗中顶端连接的关键蛋白之一Cdh23 的表达明显降低，尤其在转录水平降低的更为明显。我们通过构建Cdh23转录启动子、PKA、PKC等的抑制剂、RNA干扰、测定IP3、cAMP 的浓度变化等方法，课题组首次发现了Vlgr1受体主要是通过PKA-CREB和PKCα/γ-Sp1信号通路调节Cdh23的转录，且具有钙依赖性，并且高钙能维持Cdh23蛋白的稳定性。我们以视网膜和耳蜗作为生理模型，发现Vlgr1可以像其他的黏附受体一样在GPS位点发生自水解，且水解后的Vα、Vβ二个片段通过相互作用来介导信号通路，2个单独的Vα、Vβ片段均不能调节Cdh23的表达。我们利用点突变方法确定了Vlgr1 水解的具体位置。通过Vlgr1 与NH2OH 在不同时间、不同浓度、不同温度、不同pH 值等条件下孵育，研究了Vlgr1 自水解的生化特征和反应动力学特点，明确了GPS点上S5884位点的去质子化的氧在亲核攻击中起着非常重要的作用，这也是Vlgr1自水解的重要机制。本项目通过利用Vlgr1-/-小鼠转录组检测、CO-IP实验，并结合听功能检测，从而明确VLGR1基因突变不仅影响踝连接的形成，也影响了顶连接最重要的蛋白Cdh23表达，从而影响了顶连接形成，破坏了静纤毛束的发育和功能维持，这是导致Usher 综合征发生的重要机制之一。这些研究成果将有助于进一步了解耳聋背后的机制。将为我们从分子水平揭示Usher综合征的发病机理以及建立诊断、预防以及基因治疗方法开辟良好的前景。本研究结果将为理解USH发病机理及寻找治疗靶点提供理论依据。