p62/SQSTM1蛋白在HAMLET诱导神经胶质瘤凋亡中的作用机制

HAMLET (Human α-Lactalbumin Made Lethal to Tumor Cells) is a complex of human α-lactalbumin and oleic acid, capable of selectively killing tumor cells. To date, the mechanisms of HAMLET-induced cell death remain unclear. In preliminary studies, we found that UBA domain of the p62 protein, autophagy and caspase-8 activation play an important role in apoptosis induced HAMLET in U87MG cells in early phage. According to the research results, we propose the following hypothesis: HAMLET could cause the accumulation of p62 protein, autophagy activation, and finally actvate caspase-8 pathways that lead to apoptosis of glioma. In order to confirm the above hypothesis, this study focuses on interaction between p62 protein, ubiquitination caspase-8 and LC3 in HAMLET role in vitro and in vivo by using immunofluorescence, Pull-down and immunoprecipitation technology, and explore molecular mechanisms HAMLET- induced apoptosis, and provide new ideas and tools for the clinical treatment of glioma.

HAMLET是一种能选择性杀死肿瘤细胞的人α乳清蛋白和油酸的复合物，目前其引起细胞死亡的机制仍不清楚。在前期研究中申请人发现p62蛋白UBA结构域，自噬的发生以及随后caspase-8的激活在HAMLET诱导人U87MG神经胶质瘤细胞凋亡中起重要作用。根据已有研究成果，我们提出下面假说：HAMLET可引起p62蛋白的集聚并通过自噬激活caspase-8途径导致神经胶质瘤的凋亡。为证实上述假说，本研究拟在HAMLET作用的体内外模型中通过采用免疫荧光，Pull-down及免疫共沉淀等技术研究分析p62蛋白与泛素化caspase-8蛋白及LC3的相互作用，探讨p62蛋白在HAMLET诱导细胞凋亡中的机制，为神经胶质瘤的临床治疗提供新的思路和手段。

肿瘤细胞致死性人 α-乳清蛋白 (human α-lactalbumin made lethal to tumor cells，HAMLET)是人 α-乳清蛋白与油酸结合形成的脂蛋白复合物，具有较理想抗恶性胶质瘤（malignant glioblastoma，MG）效果，但其杀伤肿瘤的分子机制仍不清楚。 前期研究显示HAMLET可激活 caspase-8凋亡途径和自噬，据此提出HAMLET可引起p62蛋白的集聚并通过自噬激活caspase-8途径导致神经胶质瘤的凋亡的假说。为证实上述假说，本研究在细胞和动物模型中分析p62蛋白表达和Caspase 8的激活；应用自噬激活剂Rapamycin，自噬抑制剂3MA，蛋白酶体抑制剂Mg132以及氧化应激诱导剂H2O2的情况下，分析HAMLET干预后神经胶质瘤细胞中caspase-8的激活情况；干扰p62或 LC3基因的表达或缺失p62蛋白UBA结构域，观察p62表达或功能的改变和自噬体形成对HAMLET激活caspase-8的影响；采用免疫荧光，Pull-down及免疫共沉淀等技术研究分析p62蛋白与caspase-8蛋白及LC3的相互作用。另外，为了提高HAMLET的纯度和活性以及在临床上的应用，进行了HAMLET制备方法的改进和对未分化细胞小鼠前脂肪细胞3T3-L1长期作用的观察。结果显示自噬的抑制，蛋白酶体的抑制，氧化应激的发生等因素都可以促进HAMLET激活caspase-8；p62和p62蛋白UBA结构域的缺失都显著的降低了HAMLET激活caspase-8的水平，而 LC3基因的表达则无显著性改变；免疫荧光分析显示caspase-8蛋白与p62蛋白在HAMLET干预的细胞中共定位，而caspase-8在活化前并没有与LC3蛋白相互作用。同时，HAMLET通过激活自噬促进了3T3-L1未分化细胞向成熟脂肪细胞的分化。这些结果表明HAMLET通过引起氧化应激和对蛋白酶体的抑制促进了p62参与的caspase-8的聚集和泛素化从而引起caspase-8的激活导致MG肿瘤细胞的凋亡，而自噬体的形成并不参与caspase-8的激活。另外，HAMLET诱导的自噬则可促进了未分化细胞的分化，可能是其抑制肿瘤细胞增殖的机制之一。