基于KATP通道与肠道L细胞分泌GLP-1的关系探讨马齿苋生物碱降糖活性的物质基础及作用机制

Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) is secreted from intestinal L cells. Due to its multiple effects, such as promoting insulin secretion and improving insulin resistance, GLP-1 has become a hotspot in the field of diabetes research in recent years. Portulaca oleracea L. (purslane) has the same hypoglycemic effect as well as GLP-1, but its active components and their mechanisms of action have not yet been elucidated. Our previous study shows that certain alkaloids in purslane can cause the closure of KATP-channel located on islet β cells membrane, leading to the opening of L-type Ca-channel, consequently resulting in the stimulation of insulin secretion. Recent researches have shown that the KATP-channel of intestinal L cell membrane is the same as that of islet β cell membrane, and its closure can also lead to the opening of L-type Ca-channel, thus stimulating the secretion of GLP-1. However, there has been no report concerning the stimulation of GLP-1 secretion by Chinese herbal medicine through blocking the KATP-channel of intestinal L cell membrane. Therefore, this project intends to adopt the biological capture-ultrafiltration mass spectrometry and element-tracking method to guide the separation of alkaloids in purslane. Molecular docking, patch clamp, fluorescent probes, and enzyme-linked immunosorbent assay will be used to study the mechanism by which these alkaloids may affect the secretion of GLP-1 in intestinal L cells through their interaction with KATP-channel. The implementation of this project will not only provide a basis for elucidating the active compounds of purslane with hypoglycemic activity and their underlying mechanisms, but will also provide new insight for evaluating the hypoglycemic activity and associated mechanisms of other Chinese herbal medicines.

肠道L细胞分泌的胰高血糖素样肽-1（GLP-1），因具有促进胰岛素分泌及改善胰岛素抵抗等多重作用，成为近年来糖尿病研究领域的热点。中药马齿苋同样具有上述降糖作用，但其物质基础及作用机制尚未阐明。本课题前期研究发现，马齿苋中生物碱可通过关闭胰岛β细胞膜的KATP通道，使L型Ca通道开放，从而刺激胰岛素的分泌。新近研究表明，肠道L细胞膜具有与胰岛β细胞膜相同的KATP通道，它的关闭也可使L型Ca通道开放，从而刺激GLP-1的分泌。目前，中药通过此通路刺激GLP-1分泌的研究未见报道。因此，本项目拟采用生物捕集-超滤质谱法、元素追踪等方法，导向分离马齿苋中生物碱类成分，并应用分子对接、膜片钳、荧光探针、酶联免疫吸附法等技术，探讨马齿苋中生物碱基于KATP通道促进肠道L细胞分泌GLP-1的作用机制。本项目在阐明马齿苋降糖活性物质基础及作用机制的同时，也为其它中药降糖活性的作用机制研究提供了新思路。

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是由肠道L细胞分泌的一种肠促胰素，因具有促胰岛素分泌及增强胰岛素敏感性等多重作用对胰腺内外的独特作用成为近年来糖尿病研究领域的热点。中药马齿苋降糖作用显著，但对主要活性成分生物碱类的降糖活性作用机制研究未见报道。本课题前期研究发现，马齿苋中的生物碱类成分可通过关闭胰岛β细胞膜上的KATP通道来刺激胰岛β细胞分泌胰岛素。新近研究表明，肠道L细胞膜与胰岛β细胞膜上的KATP通道蛋白表达及功能相同，且KATP通道的关闭可刺激肠道L细胞分泌GLP-1。目前，中药通过此通路刺激GLP-1分泌的研究未见报道。因此，本项目(1)利用多种色谱手段（大孔树脂、硅胶、凝胶、ODS、手性制备柱及制备液相），在基于LC-Qtof/MS的元素追踪技术指导下，对马齿苋提取物中的生物碱类成分进行导向分离，从中分离得到48生物碱单体化合物。利用UV、IR、1D-NMR、2DNMR、ESI-MS、HR-MS、CD等谱图的综合解析，鉴定了这些化合物的结构，其中22个为新化合物，并采用CD实验测定和计算CD的方法确定手性化合物的立体构型，总结马齿苋生物碱的质谱、核磁等谱学规律。上述工作为马齿苋生物碱降糖活性的作用机制研究奠定了物质基础。⑵利用计算机模拟技术模拟所分离得到的单体生物碱与SUR1蛋白的结合情况，利用荧光探针和流式细胞术测定了部分单体生物碱对小鼠肠道STC-1细胞内钙离子浓度的影响，并利用酶联免疫吸附法技术测定了这些单体生物碱对小鼠肠道STC-1细胞分泌GLP-1的影响，从而从分子水平、细胞水平研究了单体马齿苋生物碱基于KATP通道促进肠道细胞分泌GLP-1的作用机制。⑶通过定向分离，对马齿苋新酰胺F进行了量的累积，并利用免疫组化技术，通过动物实验研究马齿苋新酰胺F对小鼠体内胰腺中胰岛细胞的增殖和胰岛素的分泌、肠道细胞分泌GLP-1的影响，并测定了小鼠血液中血糖的变化。通过本项基金的资助，我们阐明了马齿苋中的生物碱类成分可以通过作用于肠道细胞的KATP通道从而促进分泌GLP-1的作用机制。本项目在阐明马齿苋降糖活性物质基础及作用机制的同时，也为其它中药降糖活性的作用机制研究提供了新思路。