CaSR活化对肾小管上皮细胞胞外基质形成的影响及机制研究

Excessive deposition of extracellular matrix (ECM) is known to be the key determinant for the progression of renal fibrosis. Thus, investigations on the regulatory mechanisms of ECM formation are important for the prevention and treatment of renal fibrosis. In recent studies, calcium sensing receptor (CaSR) agonist has been found to be effective in reducing the extent of ECM deposition and renal fibrosis. However, the effect of CaSR activation at renal tubular epithelial cell level on tubulointerstitial fibrosis is still unknown. As our previous data shown, CaSR agonist could significantly attenuate renal epithelial injury and decrease the expression of ECM protein and β-catenin in tubular area. Based on these findings, we proposed the hypothesis: activation of CaSR on renal tubular epithelial cell could inhibit the synthesis of ECM and enhance the degradation of ECM through the regulation of intracellular β-catenin pathway. In this study, we plan to investigate the effeicacy of tubular epithelial CaSR activation on ECM and its possible molecular pathway by in vivo and in vitro experiments. The results of this study may shed light on mechanisms underlying the renoprotective role of CaSR agonist and may provide novel ideas for the potential therapeutic target for chronic kidney disease.

细胞外基质（ECM）过度沉积是导致肾脏纤维化进展的关键因素，探讨ECM调控机制对于肾脏纤维化防治具有重要意义。近期研究发现，CaSR激动剂具有抑制ECM异常沉积并改善肾脏纤维化的作用。但目前有关小管上皮细胞CaSR活化对肾小管间质纤维化过程中ECM形成的影响和机制仍不清楚。我们的前期研究发现，CaSR激动剂具有减轻慢性肾衰大鼠小管细胞损伤，降低小管区ECM蛋白和β-catenin表达的作用。基于上述工作基础，我们提出本研究假说：肾小管上皮细胞CaSR活化可通过调节胞内β-catenin径路，减轻损伤因素所致肾小管上皮细胞ECM的生成和/或促进ECM降解，从而抑制小管间质纤维化。本课题拟在前期工作基础上，通过体内外实验观察肾小管上皮细胞CaSR活化对ECM形成和降解的影响，以阐明CaSR激动剂改善肾小管上皮细胞损伤及小管间质纤维化的作用机制，为临床防治慢性肾衰竭提供新的思路和干预靶点。

细胞外基质（ECM）过度沉积是导致肾脏纤维化进展的关键因素，探讨ECM调控机制对于肾脏纤维化防治具有重要意义。近年来，研究发现CaSR激动剂具有抑制ECM异常沉积并改善肾脏纤维化的作用。但目前有关小管上皮细胞CaSR活化对ECM形成的影响和机制仍不清楚。因此，本研究通过体内外实验观察肾小管上皮细胞CaSR活化对ECM成分表达的影响。1. 我们在腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭（CRF）模型大鼠中观察到：CRF组大鼠肾脏纤维化病变程度，肾小管损伤评分及肾脏ECM蛋白type I、III、IV collagen的表达均较对照组显著增加，而CaSR激动剂Cina干预显著改善上述现象。2. 采用TGF-β1干预体外培养的原代近段肾小管上皮细胞（TECs）观察到：TGF-β1干预呈时间及浓度依赖性的上调细胞type I、III、IV collagen的表达，并下调CaSR的表达水平；应用CRISPR ACT质粒实现对CaSR的过表达后，细胞type I、III、IV collagen的表达水平较TGF-β1干预组明显降低，应用CRISPR/Cas9 KO质粒实现对CaSR的敲除后则发现细胞上述蛋白的表达水平较TGF-β1干预组进一步升高；应用CaSR的激动剂和抑制剂干预TECs后发现：与TGF-β1干预组细胞相比，CaSR激动剂Cina干预可下调type I、III、IV collagen的表达水平，抑制剂Calhex则上调上述ECM蛋白的表达。上述结果提示CaSR活化能够抑制TGF-β1所诱导的TECs ECM蛋白表达。3. TGF-β1干预显著上调TECs中Snail蛋白的表达水平；与TGF-β1干预组相比，CaSR CRISPR ACT质粒或激动剂Cina能够下调Snail蛋白的表达，而CaSR CRISPR/Cas9 KO质粒或抑制剂Calhex则能够进一步增加Snail蛋白的表达，从而提示Snail信号径路参与调节CaSR介导的肾小管上皮细胞ECM蛋白表达。4. 有研究显示内皮细胞同样表达CaSR，因此我们进一步应用尿毒症主动脉钙化大鼠模型观察CaSR激动剂对内皮细胞表型的影响，结果显示：与模型组相比，Cina干预组大鼠主动脉内皮细胞标志物CD31的表达显著升高，而间充质标志物FSP1的表达下降，提示CaSR激动剂可能具有内皮细胞保护效应。