线粒体自噬在高铜诱导肉鸡病理发生中的作用

Mitophagy, the selective removal of dysfunctional mitochondria by autophagy been implicated in many different physiological and pathological processes. Copper of high level causes animal cell injury in animal husbandry and become an important environment contaminant. The previous studies showed that high level copper could result in increasing of reactive oxygen species production, decreasing of mitochondrial membrane potential and dysfunction of respiratory chain, which induced oxidative stress injury. However, the molecular mechanism of mitophagy induced by high level copper is not clear. Therefor, structure and dynamic process of mitophagy were researched by flow cytometry, immune fluorescence, transmission electron microscopy, fluorescence laser scanning confocal microscopy, RT-PCR and Western Blot in broiler hepatocyte in vitro and in vivo. The changes of expression of autophagy related genes and its mRNA and regulation proteins fo mitochondrial dynamics and apoptosis proteins were examinated. The cell behaviors and effector molecules of mitophagy were investigated by mitochondrial provective agent and inhibitor. The molecular pathological mechanism of mitophagy induced by high level copper are elucidated for the basis of further research of copper toxicology.

线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程, 涉及诸多生理和病理学过程。养殖业应用高铜不仅损伤动物细胞，而且成为环境污染物。前期研究表明，髙铜诱导肉鸡肝细胞线粒体ROS生成增多，线粒体膜电势下降，呼吸链功能障碍，引起氧化应激损伤。然而高铜诱发线粒体自噬的分子病理机制尚不清楚。为此，项目通过离体肝细胞培养和在体高铜动物模型，应用流式细胞术、免疫荧光、透射电镜、荧光激光共聚焦显微镜、RT-PCR、Western Blot等技术从细胞和分子两个层面研究肉鸡在高铜环境下，细胞线粒体自噬体的结构、线粒体自噬的动态过程，检测线粒体自噬相关蛋白及其mRNA基因表达和线粒体动力学调控蛋白、凋亡蛋白表达的变化，并观察线粒体保护剂和抑制剂对线粒体自噬的细胞行为变化和效应分子的影响，从而揭示线粒体自噬在铜诱导病理发生中的分子机制，为进一步开展铜毒性分子病理学研究奠定基础。

本项目通过体内和体外实验手段，运用组织切片、透射电镜观察、流式细胞术、免疫荧光、RT-qPCR和免疫印迹等研究方法探讨肉鸡在高铜环境下，细胞线粒体自噬的结构、线粒体自噬的动态过程以及线粒体动力学调控和凋亡蛋白的表达变化，并观察线粒体保护剂和抑制剂对线粒体自噬的影响。具体研究结果如下：.1. 体内实验结果显示，高铜日粮可以诱导肉鸡肝细胞坏死、自噬体增多、细胞核固缩，TUNEL阳性颗粒增多，促进Beclin1、ATG5、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Dynein、P53、Bak1、Bax、Caspase3 mRNA表达和BECN1、P53、Bak1、Bax、Cyt C、Caspase3的蛋白表达，促进LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上调，而抑制P62、mTOR、Bcl2 mRNA表达和P62、Bcl2蛋白表达水平。.2.采用酶消化法建立鸡胚原代肝细胞模型，用以体外实验研究。结果发现，铜离子可以诱导肝细胞自噬体增多、自噬水平上升，LC3聚点数量增加，细胞S期阻滞，凋亡率上升，促进Beclin1、ATG5、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、mTOR、P53、Bak1、Bax、Cyt C、Caspase3 mRNA表达和BECN1、Bak1、Bax、Cyt C、Caspase3的蛋白表达以及上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，而抑制Bcl2 mRNA和蛋白的表达。.3.本实验利用硫酸铜和自噬干扰剂对鸡胚原代肝细胞进行联合处理研究自噬在高铜致鸡肝细胞损伤和凋亡中的作用。结果发现，硫酸铜和雷帕霉素联合组可减少细胞脱落，细胞存活率升高，ROS和H2O2含量、SOD、MDA、CAT水平以及HO-1 mRNA表达均降低，而线粒体数量、MMP以及ATP水平升高，P53、Bak1、Bax mRNA表达和Cyt C、Caspase3蛋白表达下调。硫酸铜和3-MA联合处理组与硫酸铜单独处理组相比，对上述指标却有着相反的效果。结果表明，激活自噬可能减缓高铜诱导的鸡肝细胞损伤和凋亡，而抑制自噬则具有相反的效果。.该研究揭示了线粒体自噬在高铜致肉鸡肝细胞损伤和凋亡中的作用机制，为铜毒性的分子机理研究奠定了理论基础。项目发表相关研究论文13篇，其中sci收录论文6篇；培养研究生11名，其中博士研究生2名。