西瓜MYB转录因子对枯萎病抗性调控机理研究

In a recent study , a novel MYB transcription factors, designated as ClMYB ,was isolated from watermelon root infected by Fusarium oxysporum f.sp. niveum using an Agilent custom microarray and suppression subtractive hybridization (SSH). The ClMYB genes were also induced during the incompatible interaction, but were repressed in the compatible interaction by Quantitative Real-Time PCR. In plant, MYB transcription factors play various roles in response to biotic and abiotic stimuli, as well as in secondary metabolism. The objective of this study is to clone ClMYB transcription factor on the basis of preliminary studies, and validate gene function by construction and transformation of the sense and anti-sense expression vector of ClMYB gene using gateway technology, and identify the downstream target genes and regulation of metabolic pathway of ClMYB gene by Chip-seq. These would reveal regulatory mechanism of ClMYB transcription factor gene in watermelon plants in response to Fusarium oxysporum f.sp. niveum infection. The studies also provide new insights into the understanding of the molecular mechanism in response of watermelon plants to Fusarium oxysporum f.sp. niveum infection and will be helpful in molecular breeding of Fusarium wilt resistant varieties and the development of rational strategies for control of Fusarium wilt disease in watermelon and other crops.

前期研究中,我们利用抑制差减文库和芯片技术分析西瓜抗枯萎病反应的基因表达谱,筛选出一个参与西瓜抗性早期反应的转录因子ClMYB, QRT-PCR实验表明该基因在西瓜的抗病品种中优势表达，而感病品种中没有差异表达。MYB转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子，它参与次生代谢,应答激素的刺激，抵御外界胁迫和病原菌的侵染。本项目拟在前期研究和西瓜基因组数据基础上克隆该基因,进行分子生物学鉴定；利用Gateway技术构建正、反义表达载体进行转基因的功能验证；通过染色质免疫沉淀-深度测序Chip-seq技术鉴定目的转录因子的下游靶基因及调控的代谢途径；以明确转录因子ClMYB基因与西瓜抗枯萎病反应的关系及其调控抗性反应响应的途径。研究结果为深入解析该基因调控西瓜抗病性应答反应的分子机理提供了理论基础，为西瓜枯萎病的抗病育种和病害防治提供可靠的科学依据。

本项目以参与西瓜枯萎病抗性早期反应的转录因子ClMYB为研究对象，在前期研究和西瓜基因组测序数据基础上克隆了ClMYB基因，该基因属于典型R2R3型MYB家族基因,在NCBI的登录号为KT751229。目前已完成了ClMYB基因的亚细胞定位，表明该基因定位于细胞核。通过构建pCZN1-MYB载体,转化至大肠杆菌 Arctic Express，进行 IPTG诱导pCZN1-MYB载体融合蛋白的表达，并利用SDS-PAGE对原核表达产物进行了纯化，并通过动物免疫制备抗体，抗体纯化后纯度在95%以上。利用此抗体进行了染色质免疫沉淀技术ChIP分离并鉴定目的转录因子的下调靶标基因。ClMYB基因在不同抗性材料上接种枯萎病菌后的表达分析，西瓜ClMYB基因受枯萎病菌诱导，且在抗性材料中表达比感病材料早。外源施用MeJA处理可以降低感病材料的病情指数,同时显著诱导ClMYB基因上调表达，这些结果也暗示ClMYB基因可能通过茉莉酸信号途径参与西瓜抗枯萎病反应。用GFP标记的方法，研究枯萎病菌在西瓜根系中的侵染过程。研究发现枯萎病菌在抗感西瓜寄主前期侵染过程无差异。在侵染后期，感病品种的根系产生的分生孢子能再次萌发，形成侵染的继续扩展，最后病菌完全充满根系组织，根系组织结构瓦解，病菌完成其定殖和致病的过程。在抗病西瓜品种的根系主根中，再生的孢子不萌发，侵染过程的滞后和侵染程度比较轻，植株表现为抗病，说明西瓜的抗病表现在抗定殖，而不是抗侵入。研究结果为深入解析该基因调控西瓜抗病性应答反应的分子机理提供了理论基础，为西瓜枯萎病的抗病育种和病害防治提供可靠的科学依据。