Tgif1调控Smad2对肌腱止点梯度结构形成与修复的作用及机制研究

The key point for the treatment of tendon injuries is to reconstruct the gradation structure of the tendon to bone interface: smooth transformation consist of tendon, fibrocartilage, and bone. We found there's a gradation of the volume of Tgif1 in the tendon enthesis according to the proteomics. And Tgif1 was able to regulate the transformation between tenocytes and chondrocytes by modifying Smad2. Additionally, tendon derived stem cells were found to be able to regenerate the gradation structure. We hypothese the gradation of Tgif1 results to the formation and regeneration of the gradation structure of the tendon enthesis. We propose to explore the effect of Tgif1 on various cells firstly; then investigate the mechanism of the regulation of Tgif1 to Smad2; next we will explore the role of Tgif1 in the regeneration of tendon bone insertion induced by TDSCs; finally, mimesis the expression pattern of the nature tendon enthesis in TDSCs and investigate its effect in tendon enthesis regeneration. With the help of this study, we can explain the mechanism of the formation of the tendon enthesis. Consequently, explore a new way for the repair of the tendon enthesis.

治疗腱损伤的关键在于重建腱止点梯度（肌腱、软骨与骨组成的平滑过渡），但腱止点梯度形成机制尚不明了。前期研究发现腱止点从肌腱端到骨端存在着转化生长因子影响因子1(Tgif1)从多到少的分布规律，预实验提示Tgif1可能能通过调控Smad2来介导肌腱与软骨细胞的相互转化，同时前期研究表明肌腱干细胞能促进腱止点梯度的修复。因此我们假设：Tgif1基因能通过调节Smad2来调控肌腱与软骨的相互转化，从而促进腱止点生理梯度的形成与修复。我们拟通过四步实验，来验证假说：一、通过基因修饰技术观察Tgif1表达对不同细胞细胞表型的影响；二、采用双荧光素酶检测、免疫共沉淀技术研究Tgif1对Smad2的调控机制；三、通过基因修饰技术研究肌腱干细胞促修复原理；四、应用组织工程学技术探讨人工模拟Tgif1梯度治疗腱损伤的可行性。本研究对阐明腱止点梯度形成机制、探索腱损伤治疗方法有重要作用。

治疗腱损伤的关键在于重建腱止点梯度（肌腱、软骨与骨组成的平滑过渡），但腱止点梯度形成机制尚不明了。本项目主要研究 Tgif1 基因在肌腱细胞与软骨细胞相互转化中的作用，明确 Tgif1基因对 Smad2 的调控机制，并通过研究肌腱干细胞促修复作用机制，探讨组织工程学治疗腱止点损伤的可行性。在本项目中，我们通过沉默/过表达 Tgif1 后检测 Smad2 的表达情况，并通过染色体免疫共沉淀验证了Tgif1 与 Smad2 的相互作用关系。利用RT-PCR和Westernblot多次进行检测相关基因表达情况，结果显示过表达TGIF1蛋白时磷酸化的Smad2减少，相应的软骨相关基因Sox9及Aggrecan基因表达降低；相反，沉默TGIF1蛋白后软骨相关基因表达增强，肌腱干细胞软骨能力增强。成功构建大鼠肩袖损伤模型通过纤维蛋白胶原装载修饰的肌腱干细胞填补腱骨损伤模型上，利用TGIF1沉默或过表达的肌腱干细胞进行修复，在2周和4周之后进行组织标本HE和番红O快绿染色，结果显示沉默TGIF1基因的肌腱干细胞组修复腱骨连接处的效果好于对照组和过表达TGIF1组，且在沉默TGIF1组中腱骨连接处新生的纤维软骨多于对照组和过表达TGIF1组。通过本项目的研究，明确了Tgif1 对 Smad2、TGFβ -Smad-Sox9 信号通路的影响，明确 了Tgif1 对细胞表型的影响，阐明了腱止点梯度结构的形成机制，明确了 Tgif1 在TDSCs 引起的促腱止点结构修复与再生作用中的角色，为腱-骨连接组织的修复重建提供新线索。