甾醇氧乙酰基转移酶（SOAT）在茯苓酸生物合成途径中的功能解析

Poria cocos is an important traditional Chinese medicine. With the increase of demand, the contradiction between P. cocos planting and forest resources protection is becoming more and more sharp. Pachymic acid, main active ingredient of P. cocos, being produced by biological engineering, which will be an important direction of P. cocos industry sustainable development. The research of biosynthetic pathway is the theoretical basis for biosynthesis of pachymic acid. The biosynthetic pathway was proposed according our previous research. In the pathway, sterol O-acyltransferase (SOAT) may be key enzymes. The enzymes can catalyze tumolusic acid and 16a-hydroxy trametendic acid to pachymic acid and 3-O-16a-hydroxy trametendic acid, respectively. In transcript of P. cocos, 3 Unigenes were annotated to SOAT. This project will focus on the genes and try to revolving the function of the genes through eukaryotic expression, enzymatic reaction in vitro, yeast complementary functions, gene silencing and gene over-expression. This study will contribute to fully disclose the biosynthetic pathways of pachymic acid. On the other hand, the study will be conducive to further reveal the formation rule of quality and build theory basis for breeding and cultivation of P. cocos.

茯苓是我国传统大宗药材，随着需求的增加，茯苓种植与森林资源保护的矛盾日益尖锐。运用生物技术来生产药效物质茯苓酸将是茯苓产业可持续发展的一个重要方向。研究茯苓酸的生物合成途径是通过合成生物学生产茯苓酸的基础。申请者前期研究推导出了茯苓酸的生物合成途径。其中，甾醇氧乙酰基转移酶（SOAT）分别催化土莫酸和16α-氢化松苓酸生成茯苓酸和3-氧-乙酰基-16α-氢化松苓酸。本研究从茯苓转录组测序注释到的3条SOAT基因片段出发，分别克隆其基因全长，应用真核表达及体外酶活性测定、酵母功能互补验证、基因沉默和过表达等方法解析SOAT在茯苓酸生物合成途径中的功能，并揭示该基因表达对茯苓酸合成代谢的影响。本研究将为全面解析茯苓酸的生物合成途径打下基础，并拓展对三萜类化合物尤其是甾醇类化合物生物合成代谢的认识。同时也将有利于进一步揭示茯苓质量形成规律，为茯苓优良菌种培育奠定一定的理论基础。

茯苓（Wolfiporia cocos）是一种药食两用真菌，以干燥菌核入药，具有健脾和胃、渗水利湿、宁心安神等功效，其中茯苓酸是其主要质量指标成分和医药活性成分。目前砍伐松木作为培养料栽培茯苓，随着茯苓需求量的增加，对森林资源的消耗日益严重，茯苓生产和森林保护的矛盾日益尖锐。运用生物工程技术来生产茯苓酸以及代料栽培茯苓成为茯苓产业可持续发展新途径。而研究茯苓酸的生物合成途径及代谢调控为使用生物工程技术和代料栽培技术生产茯苓或茯苓有效成分提供理论基础。本项目在代谢组研究基础上，推导出了茯苓酸可能的生物合成途径。根据该途径，结合本项目组进行的茯苓转录组和基因组研究，筛选到了参与茯苓酸生物合成的甾醇氧乙酰基转移酶基因和CYP450基因。根据项目任务书，本研究分别克隆得到了候选基因全长，并对其序列进行了分析；同时通过转化获得相关基因的过表达和基因沉默转基因菌株，并对转基因菌株进行基因表达分析和靶向代谢组学研究，解析相关基因功能。研究结果对进一步完成解析茯苓酸的生物合成途径提供了方法学借鉴和奠定了一定的基础。具体研究结果如下：.1.从茯苓中克隆得到了SOAT基因Wcsoat，CDS编码区全长1839 bp，编码612个氨基酸，氨基酸序列中没有蛋白水解酶。该蛋白为不稳定的疏水蛋白质，且不具有信号识别功能。该基因编码的蛋白质是有着7段跨膜区的膜蛋白，属于膜结合氧乙酰基转移酶超家族，大小约为68 kDa 。.2.Wcsoat基因表达和茯苓酸含量受添加外源茉莉酸甲酯诱导，且其基因表达量变化与茯苓酸含量变化一致，初步表明Wcsoat基因与茯苓酸生物合成相关；在此基础上进一步在茯苓体内过表达和沉默Wcsoat基因，其菌丝中茯苓酸含量受基因表达的正调控，证明Wcsoat基因参与了茯苓酸的生物合成。.3.从茯苓中成功克隆WcCYP118、WcCYP158、WcCYP220与WcCYP153,其中WcCYP158与WcCYP118属于真菌CYP64-like，WcCYP220属于CYP450 52家族，WcCYP153可能属于CYP FUM15-like 。.4.通过对克隆到的CYP450基因过表达菌株和基因沉默菌株进行靶向代谢组学分析，表明WcCYP118、WcCYP153与WcCYP220参与了茯苓酸的生物合成途径，并扮演了重要角色。