钙离子介导的热激蛋白dnaK操纵子对拜氏梭菌代谢的调控研究

CaCO3 addtition led to at least 125% higher total solvent production by Clostridum beijerinckii NCIMB8052, and the heat shock protein dnaK was highly transcripted and expressed in the CaCO3 treatment cell. It was hypothesized that the calcium ion could stimulate the expression of dnaK operon, as general positive regulator. In this proposal, the responses mechnism and corresponding target in the dnaK operon to the addition of CaCO3 will be investigated, which inculding the anti-stress activity assay of heat shock protein DnaK in vitro; the up-regulation of dnaK operon, and the transcription, expression, and activity analysis of the key enzymes during the solventogenic metabolism; comparasion of the fermentation parameters between the wild-type strain and recombinant strains with and without addition of CaCO3. The objective of this study is to identify and illustrate the mechnism of high expression of dnaK operon by stimulating of calcium ion. Based on this research of calcium-mediated heat shock protein dnaK operon on the metabolism regulation of C. beijerinckii, and the constructed high-butanol producing recombinant strains, it will provide significant experimental data and more theoretical support to the industrial bio-butanol fermentation.

本实验室研究发现CaCO3促进了拜氏梭菌产溶剂代谢，可增加总溶剂产量达125%，并显著提高了胞内热激蛋白dnaK操纵子的转录和表达,推测拜氏梭菌中,钙离子可通过促进热激蛋白高表达来正调控全局代谢,并提高细胞的抗逆性。本课题拟对热激蛋白dnaK操纵子在响应CaCO3后对细胞代谢的调控途径及作用靶标进行研究，内容包括热激蛋白dnaK体外抗逆活性测定分析；对dnaK操纵子进行不同的上调表达后的产溶剂代谢途径及代谢产物分析；并比较野生菌株及重组菌株对Ca2+的添加与否的不同表现，最终确定Ca2+促进热激蛋白dnaK操纵子高表达的方式，进一步阐明Ca2+通过对热激蛋白dnaK操纵子的调控进而促进细胞产溶剂代谢的机制，并以此为基础构建高产丁醇的工程菌株，为深入研究拜氏梭菌代谢，提高发酵产率，进行工业发酵生产提供数据支持，奠定理论基础。

本实验室研究发现CaCO3促进了拜氏梭菌产溶剂代谢，并显著提高了胞内热激蛋白dnaK操纵子的转录和表达，推测拜氏梭菌中，钙离子可通过促进热激蛋白高表达来正调控全局代谢，并提高细胞的抗逆性。.C. beijerinckii NCIMB8052 dnaK操纵子grpE、dnaK、dnaJ基因分别进行了原核表达和纯化，GrpE、DnaK和DnaJ的纯化蛋白体外的抗逆实验显示其并不能显著地提高产溶剂代谢途径关键酶CoA转移酶的活性。.通过连续传代培养获得一株不产溶剂的C. beijerinckii退化菌株DG-8052，并证实了CaCO3可以显著恢复退化菌株产溶剂的能力。DG-8052在添加4 g/L CaCO3的发酵培养基中，其产溶剂能力从原来的相当于野生菌株的5%恢复至43%。通过蛋白质双向电泳研究了CaCO3对退化菌株DG-8052蛋白表达谱的影响，结果显示培养基中添加了CaCO3后，DG-8052总蛋白(1842个)中13个蛋白在产酸期显著上调表达，12个蛋白在产溶剂期显著下调表达；对显著性差异较大的蛋白进行质谱测序，结果表明CaCO3促进了与细胞分裂、生长和产溶剂代谢相关的蛋白表达，推测除了CaCO3缓冲作用外，Ca2+可能是通过稳定热激蛋白（HSPs）、增加DNA的合成和复制，进而提高DG-8052细胞中的产溶剂代谢途径相关酶的表达来起作用的。.设计定制了C. beijerinckii NCIMB8252的mRNA转录芯片，研究了钙离子促进退化菌株DG-8052代谢的机制。培养基中添加了CaCO3后，DG-8052发酵过程中显著上调转录的基因在产酸期有565个，产溶剂期有916个，经注释归类，这些基因集中在氨基酸转运与代谢途径、有机酸合成途径、细菌趋化性和防御系统；DG-8052发酵过程中显著下调转录的基因在产酸期有704个，产溶剂期有1044个，这些基因集中在跨膜转运、ATP合成以及氧化磷酸化系统。芯片分析结果显示Ca2+可显著提高DG-8052细胞对碳源的转运和代谢、氨基酸的合成和代谢，促进了细胞的分裂和芽孢形成，最终显著恢复退化菌株DG-8052产溶剂的能力。.本研究阐述了Ca2+介导的热激蛋白对拜氏梭菌产溶剂代谢的调控代谢机制，为以此为基础构建高产丁醇的工程菌株提供数据支持；退化菌株的蛋白组学和转录芯片分析数据也为进一步研究退化机制提供了研究基础。