益气解毒法调节肝干细胞诱导分化及其调控机理研究

我国乙肝病毒感染者已达1.2亿。病毒的感染会导致肝病的慢性化，由于缺乏有效清除病毒的药物和方法，在病程延长和某些特殊因素作用下，可导致肝脏受损，引起重症肝炎、肝癌等而危及生命。乙肝病毒类似中医学的"湿热""疫毒"，当人体正气不足，则湿热、疫毒入侵而致病。其临床证型多见肝郁脾虚、或湿热内蕴等。.课题组前期进行了"疏肝健脾法"调节肝干细胞诱导分化及其作用机理的研究，发现"疏肝健脾法"能够通过上调HGF、EGF、CTG等细胞因子促进肝干细胞的增殖、分化，并具有抑制肝干细胞凋亡的作用。因此，在研究单一证型的基础上，拟从慢乙肝病因入手，进一步用"益气解毒法"对调节肝干细胞诱导分化等进行相关研究。.选择体外培养大鼠肝干细胞系和大鼠体内肝干细胞增殖模型，选用西洋参、牛黄有效成分观察"益气解毒法"对肝干细胞系诱导分化，增殖的影响和对大鼠肝再生的效果。从而为治疗慢性乙肝病提供新的思路与方法。

目的 西洋参、牛黄具有益气养阴、清热解毒的功能，符合“益气解毒法”的基本原则。将两药配伍后的水煎剂与有效成分胶囊剂对比，观察“益气解毒法”对大鼠肝干细胞系分化，增殖及凋亡的影响和对大鼠肝再生的效果，探讨益气解毒法治疗慢性肝病的作用原理。方法 1.采用不同浓度的牛黄参含药血清(5%、10%、20%)，作用于大鼠肝干细胞系WB-F344，并以正常大鼠血清(5%、10%、20%)处理的WB-F344为空白对照组，以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组；MTT法检测不同浓度含药血清对WB-F344 增殖的影响；取增殖的药物血清最佳浓度，Western blotting检测该浓度含药血清对WB-F344细胞因子HGFR、EGF、EGFR、TGFβ1R、TGFβ2R表达的影响；RT-PCR法检测其对WB-F344 AFP、ALB mRNA表达的影响；流式细胞仪检测其对WB-F344细胞凋亡率的影响。2.运用2-AAF加2/3肝切除法制作大鼠肝干细胞增殖模型；免疫组化法检测肝干细胞表面标志物CK8、CK18、PCNA和波形蛋白的表达，进行模型评价；观察各组HGFR、EGFR、FGFR、TGF-αR和TGFβ2R的表达。结果 1.经具有益气解毒功效的牛黄参含药血清干预后，MTT结果显示，10%、20%浓度的牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖，且10%为增殖的最佳浓度梯度；Western blotting结果显示，经10%牛黄参含药血清处理的WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R的表达量明显上调；RT-PCR结果显示，WB-F344细胞AFP mRNA的表达随时间的延长逐渐下降，而ALB mRNA的表达则逐渐升高；流式细胞仪结果则显示，WB-F344细胞凋亡率显著下降；且成分组略优于水煎组。2.有效建立增殖模型；益气解毒法能够促进EGFR等细胞因子受体的表达，且成分组优于水煎组。结论 益气解毒中药可以促进WB-F344细胞的增殖，抑制其凋亡，并通过细胞因子体系诱导WB-F344细胞向肝细胞特性方向的分化，且成分剂牛黄参胶囊疗效优于西洋参、牛黄的水煎剂，为益气解毒中药促进肝再生和肝损伤的修复提供了依据，同时也为临床运用不同剂型的中药复方诱导分化肝干细胞奠定了理论与实验基础，并填补了西洋参、牛黄类中药在肝干细胞研究方面的不足。