Kir2.1内向整流钾电流主导的和HCN电流的精确平衡在自律细胞起搏中的作用研究

The rate and rhythm of cardiac contration are controlled by cardiac sinoatrial node and conduction system. Dysfunction of sinoatrial node and/or conduction system could induce slow arrhythmia, which is one of the most common cardiac diseases in people over 40 years old, is mainly treated by implantation of an electronic pacemaker at present. However, the mechanism of cardiac pacemaker activity is still not very clear. Our previous results showed that precise balance between complete inwardly rectified IK1 and HCN2 currents can induce the initiation of spontaneous action potentials, providing a new idea in studying the mechanism of pacemaker activity. We propose that Kir2.1-controlled precise balance with HCN current may be the new mechanism of cardiac pacemaker cells. In order to testify the hypothesis, we plan to employ pacing iPSC-CMs, rat neonatal cardiomyocytes (RNCMs), cardiac sinoatrial node cells and purkinje cells of gene knock-in mice to explore the role of precise balance between Kir2.1 and HCN currents in cardiac pacemaker activity and the key role of Kir2.1 current in the balance from levels of molecules, cells and in vivo by using patch clamp, virus transfection, site-directed mutagenesis and molecular biology. The present study will uncover a new underlying mechanism of pacemaker activity and it will be a therapeutic target for slow arrhythmia caused by dysfunction of sinoatrial node and/or conduction system.

心脏窦房结及传导系统控制着心脏正常收缩的频率和节律，由窦房结和/或传导系统功能障碍引起的严重缓慢型心律失常，是40岁以上人群常见的心脏疾病之一，目前仍然以植入电子起搏器治疗为主。然而，心脏自律细胞起搏的确切机制迄今仍不是十分清楚。我们前期的实验证明，具有完全内向整流性的IK1和HCN2电流精确平衡能促进自发动作电位的产生，为研究起搏机制提供了新的思路。因此，我们推测：Kir2.1电流主导的和HCN电流的精确平衡可能是自律细胞起搏的新机制。为了验证这一假说，本项目拟采用具有自律性的iPSC-心肌细胞、乳鼠心肌细胞以及转基因小鼠心脏的窦房结和蒲肯野细胞，利用分子生物学，病毒转染，定点突变，膜片钳等方法，从分子，细胞以及整体水平来剖析Kir2.1电流主导的和HCN电流的精确平衡在起搏中的作用。本研究有望阐明心脏自律细胞起搏的机制，为心动过缓的防治策略和药物靶点提供新的线索和理论依据。

Kir2.1内向整流钾电流在维持细胞膜电位极化中发挥着极其重要的作用，而细胞膜电位与很多生理活动有关。在前期的研究中发现，Kir2.1电流和HCN电流的精确平衡能让HEK293细胞自发的产生节律性的动作电位，因此，进一步对乳鼠心肌细胞自发动作电位产生的机制展开研究。我们在有节律性收缩的乳鼠心肌细胞记录到了动作电位和Kir2.1及HCN电流，这两种电流在-55mV时的比值介于0.2-0.48之间，这与我们在HEK293细胞上得到的结果几乎一样。利用改变细胞外液K+浓度或阻断剂打破Kir2.1电流和HCN电流的平衡后，乳鼠心肌细胞的自发动作电位也消失。分别构建沉默Kir2.1基因和过表达Kir4.1基因的腺病毒，同时转染乳鼠心肌细胞72小时后，能节律性收缩的细胞明显减少。另外，我们还发现，Kir2.1电流控制的膜电位通过影响钙离子内流而参与巨噬细胞的极化过程。Ba2+或ML133阻断Kir2.1电流后，抑制巨噬细胞M1极化，而促进M2极化。通过提高细胞培养液中的K+浓度使细胞膜电位降低后，巨噬细胞的M1极化受到显著抑制，而增加培养液中的钙离子则可以抵消这种作用。分子生物学实验结果表明，Kir2.1电流控制的细胞膜电位通过钙离子及CaMK/ERK/NF-κB信号通路参与巨噬细胞极化。我们的研究深入揭示了Kir2.1电流控制细胞膜电位在乳鼠心肌细胞自发动作电位产生中的作用以及在巨噬细胞极化中的重要作用。