铁皮石斛内生菌多样性及其促进铁皮石斛活性成分积累的机理研究

The diversity of endophytes and accumulation of active components of the host plant are impacted by each other. Based on the reports and our pilot studies, our hypothesis is that endophytes induce the accumulation of the polysaccharides and alkaloids of Dendrobium officinale by impacting the key enzymes of the synthetic way of polysaccharides and alkaloids of Dendrobium officinale. The project will research the diversity of endophytes (species distribution, metabolites) and the mechanism which endophytes promote accumulation of active components of Dendrobium officinale. We will analysis diversity of endophytes through PCR-DGGE and 454 focal phosphoric acid sequencing technology, screen functional strains, isolate and identify the metabolites of endophytes, discusse the diversity of metabolites. We will study on how the endophytes induce accumulation of active components of Dendrobium officinale from cell and plant levels by plant cell and tissue culture method. We will research how the picked strains affect the key enzymes of the synthetic way of polysaccharides and alkaloids of Dendrobium officinale by application of molecular biology, microbiology, modern spectrum technology and principal component analysis. Reveal the mechanism of promoting the accumulation of active components and expound how the endophytes effect the quality of chinese herbal medicine.

内生菌与植物间互作影响内生菌多样性及植物活性成分积累，基于文献报道和前期相关研究积累，项目提出：铁皮石斛内生菌促进其活性成分积累是通过内生菌诱导石斛多糖和生物碱合成途径中关键酶表达而实现的假说，项目拟在探明内生菌多样性（种群、代谢物）基础上，开展铁皮石斛内生菌促进其活性成分积累的机理研究。研究思路：（1）通过PCR-DGGE及454焦磷酸测序技术分析铁皮石斛内生菌多样性，筛选功能菌株并分离鉴定功能菌的代谢物，探讨内生菌代谢物多样性。（2）应用植物细胞与组织培养方法，从细胞与植株两水平研究筛选并研究有益内生菌对铁皮石斛活性成分生物合成的诱导作用；（3）应用分子生物学、微生物学、现代波谱技术以及主成分分析(PCA)等方法研究有益内生菌对铁皮石斛活性成分合成途径关键酶的影响。揭示铁皮石斛内生菌促进其活性成分积累的机理，为从内生菌角度阐明中药材品质及道地性形成进行前期探索与实践。

内生菌与植物间互作影响内生菌多样性及植物活性成分的积累。在探明铁皮石斛内生菌种群多样性及代谢产物多样性基础上，开展铁皮石斛内生菌促进其活性成分积累的机理研究。首先，分别应用PCR-DGGE和高通量测序法分析不同产区铁皮石斛内生菌丰度、多样性和种群结构；其次，通过传统的组织分离印迹对照法分离内生菌，用平板对峙法、杯碟法和细胞培养法体外筛选抑菌、抗肿瘤等功能菌株，并分离鉴定功能菌的代谢物，探讨内生菌代谢物多样性。分别采用苯酚-硫酸法和酸性染料比色法检测内生菌对铁皮石斛多糖和生物碱积累的诱导，筛选对铁皮石斛悬浮培养细胞及幼苗活性成分具有诱导作用的有益菌。最后，应用实时荧光定量PCR方法，从分子水平研究有益内生菌对铁皮石斛活性成分铁皮石斛多糖和生物碱的生物合成途径中关键酶表达的诱导作用，从而初步揭示铁皮石斛内生菌促进其活性成分积累的机理。. 铁皮石斛内生菌种群多样性研究结果显示，铁皮石斛内生菌多样性较为丰富，且因产地、组织不同呈现分子多态性，为研究宿主铁皮石斛与内生菌的相互关系提供了一个新方法。铁皮石斛内生菌代谢产物多样性分析结果显示，共分离得到145株内生菌（真菌68株和细菌77株），筛选出具有抑菌和抗肿瘤等特定功能的内生菌39株（真菌18株，细菌21株），并从部分内生菌代谢产物中分离鉴定出多种单体化合物，分析了代谢产物的多样性，为资源开发方面通过内生菌的筛选、发酵获得一些特定的宿主植物活性成分或新颖内生菌代谢产物提供了可能。通过分析内生菌对铁皮石斛悬浮细胞及幼苗多糖和生物碱积累的影响，获得了与铁皮石斛活性成分积累相关的有益内生菌3株。有益内生菌对活性成分多糖和生物碱合成途径中关键酶的诱导结果显示，内生菌NTMRz3和NTMRz10均可显著提高铁皮石斛UGPase、dTGD、HMGR、DXS、FPS和GPS基因的表达量，初步揭示了铁皮石斛内生菌促进其活性成分积累的机理，为解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等因素带来的药源紧张提供了一个新的参考方向，具有较好的开发利用潜力和应用价值。