基于畜禽肠道健康的抗菌抗内毒素嵌合肽“LBP-linker-AMP”创制及其作用机制研究

The strategies of mulfunctional chimeric peptides with different linkers based on “bacterium-toxin symphysial therapy” to control livestock and poultry bacterial diarrhea will be focused on the following three aspects: 1) design of the novel non-cleavable chimeric peptides (LBP-linker-N2/N6) based on LBP-14, flexible or rigid linker and AMP (N2/N6), and evaluation of its stability and resistance, bactericidal activity against Escherichia coli, ability to neutralize LPS and inhibit inflammation in vitro and in vivo; 2) elucidation of the anti-bacterial, anti-toxic, and anti-inflammatory properties of cleavable chimeric peptides (LBP-linker-Lfcin4/Lfcin5) with a cleavable linker against Salmonella enteritidis in vivo; 3) explanation the molecular mechanism of these chimeric peptides with low bacterial resistance, including their interactions with LPS and modulation inflammatory responses. This provides a new idea for the design and development mulfuntional chimeric peptides to fight the gram-negative bacterial infection via multiple target sites in livestock and poultry.

本项目在课题组专抗G−、广谱性抗菌肽研究前期工作基础上，应用细胞学、分子生物学和免疫学技术从细胞、分子水平研究“非剪切嵌合肽”和“剪切嵌合肽”对畜禽腹泻G−致病菌的杀菌、中和LPS及抑制炎症及其相关机制，研究内容：1）基于“linker基因工程”技术联合应用LBP-14、非剪切linker和专抗G−抗菌肽（N2/N6）设计新型高效、低毒多功能“非剪切嵌合肽”，并明确其对畜禽肠道致病菌大肠杆菌的精准靶向杀菌、中和LPS及阻断炎症功能；2）研究由LBP-14、剪切linker和广谱抗菌肽（Lfcin4/Lfcin5）组装的“剪切嵌合肽”对畜禽肠道致病菌沙门氏菌“菌毒并治”的效能；3）初步阐明“非剪切嵌合肽”和“剪切嵌合肽”中和畜禽腹泻致病菌G− LPS的分子机制及抑制炎症反应的分子机制。这为设计新型多功能嵌合肽提供了重要的理论依据，也为畜禽肠道细菌性疾病的多位点协同防控另辟途径。

本项目在前期工作基础上，应用细胞学、分子生物学和免疫学技术从细胞、分子水平研究“非剪切嵌合肽”和“剪切嵌合肽”对畜禽腹泻G−致病菌的杀菌、中和LPS及抑制炎症及其相关机制，取得了以下研究结果：1）基于“linker基因工程”技术联合应用LBP-14、非剪切linker和专抗G−抗菌肽（N2/N6）设计、合成非剪切嵌合肽A6、G6，证明了A6、G6对畜禽肠道致病菌大肠杆菌的精准靶向杀菌、中和LPS及阻断炎症功能，并具有高稳定性、低毒性和低耐药；2）由LBP-14、剪切linker和广谱抗菌肽（L7）组装的剪切嵌合肽R7对畜禽肠道致病菌沙门氏菌具有“菌毒并治”的双功能效果；3）初步阐明嵌合肽中和畜禽腹泻致病菌G− LPS的分子机制及抑制炎症反应的分子机制，A6和G6主要通过阻断有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)激活调节炎症反应。R7通过下调TNF-α、IL-6和IL-1β，上调IL-10和IAP的水平来抑制炎症反应。此外，研究发现嵌合肽在小鼠体内的治疗效果要优于相同剂量的硫酸粘杆菌素，这为为畜禽肠道细菌性疾病的多位点协同防控另辟途径。