球孢链霉菌转录调节基因atrA的多效性调控机制的研究

抗生素生物合成处于复杂的、多级水平的调控网络之中，外部信号可通过多效性调节基因控制抗生素途径特异性调节基因，最终影响次级代谢产物的合成。AtrA是首先从天蓝色链霉菌中发现的多效性调节因子，正调控放线紫红素的产生。随后发现atrA在其他链霉菌中广泛存在且高度保守，对抗生素具有不同的调节作用。力达霉素是球孢链霉菌（Streptomyces globisporus）C-1027产生的新型抗肿瘤抗生素，其生物合成基因簇中至少存在5个调节基因，具有复杂的生物合成途径特异性调控机制。申请者发现球孢链霉菌中具有atrA的同源基因，并影响力达霉素的产生。本课题拟采用分子遗传学、生物信息学和基因组学等手段，确定atrA对力达霉素途径特异性级联调控网络的分子调控机制，并进一步鉴定其调控的其他靶基因及其上游调节蛋白，阐明其在球孢链霉菌中对次级代谢等过程的精细调控机制，丰富对链霉菌次级代谢分子调控机理的认识。

链霉菌抗生素生物合成的分子调控是一个复杂而多级水平的调控网络，不同的外部信号可通过多效性调节基因控制途径特异性调节基因，最终影响次级代谢产物的合成。力达霉素（Lidamycin，又名C-1027）是由Streptomyces globisporus产生的一种具有极强抗肿瘤活性的烯二炔类抗生素，其生物合成途径及途径特异性调控机制已被初步阐明。TetR家族的多效性转录调节蛋白AtrA首先在S. coelicolor中被发现，它可以结合在放线紫红素的生物合成途径特异性调节基因actII-orf4的上游，正调控放线紫红素（ACT）的产生。本课题组用新一代测序技术获得了S. globisporus C-1027的全基因组序列，发现了其存在同源蛋白AtrA-gl，并通过基因阻断和回复、实时定量PCR分析、EMSA、DNase I footprint、ChIP-PCR等一系列体内外实验证实了AtrA-gl可以结合在力达霉素途径特异性调节基因sgcR1的启动子区域，正调控力达霉素的产生。进一步研究发现AtrA-gl与DNA的结合活性可被力达霉素生物合成的中间体七烯所抑制，此外，其活性也受放线紫红素的调节。多效性调节蛋白AtrA在链霉菌属中高度保守，以上结果提示其介导的负反馈调节有可能协调种内不同次级代谢产物的产生，并且这种机制可能在链霉菌中普遍存在。除对次级代谢的调控外，我们还证实AtrA-gl可以与编码GlcNAc透膜酶的nagE2-gl基因的启动子结合，参与GlcNAc的摄取和转运过程。为进一步探索AtrA在链霉菌中的生物学作用，我们利用ChIP-seq技术在S. globisporus C-1027全基因组范围内寻找AtrA的调控靶标。通过BayesPeak峰识别软件共得到385个峰，分布于线性染色体及线性质粒上，约93.8%（361/385）的峰都包含类似GGAAN7TTCC的序列，提示此序列是AtrA的一致性结合序列，这些峰是AtrA潜在的结合靶标。通过COG、KEGG Pathway和antiSMASH分析，提示AtrA调控的靶基因主要参与氨基酸、碳源等营养物质的转运和代谢，参与菌株形态分化以及其他次级代谢产物生物合成等过程的调控，相关机制正在进一步深入研究中。