大鼠肾发育中微细结构的三维重建及细胞凋亡的初步研究

The millions of nephrons formed during renal development ,and formed diaphanous fine structure and strict space align. The structural complexity was the groundwork of normal absorptive function. The applicant has researched morphologic regularity of rat renal development, which provided substantial morphologic foundation to investigate the relationships of structure and function. Previous research was limited to two-dimension pictorial qualitative description, so fine structural succession was dimness during renal development.However traditionary renal three-diamensions research mainly describe succession two-dimension micrograph, which employment was heavy and three-diamensions message was limit. This item is going to aim directly at rat nephridial tissue during development, and utilize fabrication technique of improved biological specimen and improved immunohistochemisty technique. The purpose is three diamensions visualization of fine structure during renal development,and site-specific describe and tracing the expression of apoptotic associated protein. At the same time, the research will reveal the developed regularity of fine structure, and approach apoptotic succession during rat renal development.The research is helpful for the renal physiology and understanding reticular molecular biology mechanism during renal development,and consummate the theory of renal development.

肾脏在发生发育过程中形成了上百万肾单位，具有精致的微细结构和严格的空间排列，这种结构的高度复杂性是执行正常重吸收功能的基础。申请人在前期工作中，系统地研究了大鼠肾脏发生发育的形态学变化规律，为进一步探讨肾发育中结构和功能的关系提供了坚实的形态学基础。但以往的研究仅限于对二维显微图像的定性描述，对肾发育中各种微细结构的演变还不清楚；而传统的肾三维微细结构研究主要对连续二维显微图像进行描述，工作繁重，三维信息有限。此次申请的项目针对大鼠发生发育肾组织的特点，应用改良的生物标本制作技术和免疫组化检测技术，拟将大鼠肾发育中的微细结构三维可视化，定位描述并三维追踪细胞凋亡相关蛋白的表达，揭示大鼠肾组织微细结构发生和演变的细节和规律，并探讨大鼠肾发育中细胞凋亡的演变规律，以及凋亡通路等的内在联系，为肾脏生理功能的研究及解读错综复杂的肾发育分子生物学机制提供组织细胞学依据，共同完善肾发生发育理论。

肾脏是发生发育期受不利的环境因素影响，在成年期将发生某些疾病的重要器官之一。细胞凋亡贯穿在肾发育的全过程，是肾发育中的重要事件。.本研究培养了不同胚龄和生后日龄的大胎鼠及大仔鼠，将其进行石蜡和树脂包埋，随后连续切片，对各切片进行甲苯胺蓝染色，通过显微摄像系统进行摄像，建立大鼠肾不同发育阶段的显微图像库。初步对胚龄18天大鼠肾进行三维追踪。同时在显微图像库中根据不同的时间点等间隔选取连续切片，进行Caspase依赖的细胞凋亡通路相关蛋白（线粒体通路，死亡受体通路和内质网通路）的定位检测，并应用蛋白印迹技术检测大鼠肾发育各时期Caspase依赖的细胞凋亡通路相关蛋白的定量表达，随后在电子显微镜下观察肾单位各组成成分在肾发育中的亚细胞结构变化。.实验结果显示，在大鼠肾发育中，Caspase依赖的细胞凋亡通路的相关蛋白的表达从深层肾皮质区逐渐扩展到中层肾皮质区，最后位于整个肾皮质区。对于线粒体通路介导的细胞凋亡来说，在肾发育中，Cyt-c强烈表达在皮质迷路的近端小管和远端小管中，微弱表达在髓放线的近端小管与远端小管中。而Apaf-1和Capspase-9则强烈表达在皮质迷路的近曲小管，而远端小管则未见表达;免疫蛋白印迹结果显示， Cyt-c介导的线粒体细胞凋亡通路相关蛋白在大鼠肾发育的早期起着非常重要的作用，而在生后发育的后期，则表达微弱。对于死亡受体通路介导的细胞凋亡来说， CD95、FasL和Cleaved-caspase-3强烈表达在肾各发育期的近端小管，微弱表达在远端小管。而Caspase-8则表达在近端小管与远端小管，但远端小管的表达强于近端小管。免疫印迹结果显示CD95 所介导的死亡受体细胞凋亡通路在胚胎期表达微弱，但在生后发育的后期表达强烈。.通过对大鼠肾发育中线粒体通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡的研究结果显示，在大鼠肾发育中近端小管比远端小管更易发生细胞凋亡，生后肾发育早期近端小管的细胞凋亡是由Cyt-c所介导的线粒体细胞凋亡通路所介导的，而生后肾发育后期近端小管的细胞凋亡则由CD95所介导的死亡受体通路介导的。远端小管的细胞凋亡是由其它caspase依赖的细胞凋亡通路介导的，此凋亡通路或许通过Caspase-8的串话来介导的。.对大鼠肾发育中细胞凋亡的定位研究，为肾生理功能的研究及理解肾发育中错综复杂的分子生物学机制提供了组织学依据。