全基因组DNA甲基化和组蛋白H3K79甲基化在MLL-ENL白血病中的相互作用机制研究

DNA methylation and histone modifications play a key role in hematogenesis and leukemogenesis. MLL related leukemia is often accompanied by aberrant DNA methylation and altered histone modifications. Previous studies have shown that MLL fusion proteins enhance gene expression by recruitment of H3K79 methylation and prevention of DNA methylation. In comparison to normal lymphocytes, thousands of gene promoters exhibit increased levels of H3K79 methylation in MLL related leukemia, suggesting MLL fusion proteins have widespread targets in the genome. However, very limited effort has been taken to identify the DNA methylation aberrations mediated by MLL fusion proteins on genome-wide scale. In the present study, we propose to exploit the comparative genomics analyses together with biological functional studies to systematically understand the effect of MLL fusion protein (MLL-ENL) on genomic DNA methlytion and histone H3K79 methylation. Using a MLL-ENL-inducible system, we plan to map the genomic loci with epigenetic alterations and generate gene expression profiles for cells in the "ON" or "OFF" states of the MLL-ENL fusion protein. In addition, we will undertake the strategies of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and shRNA inhibition, to scrutinize the relationship between the H3K79 methylation and the genomic DNA methylation. We will consequently establish the transcriptomic and epigenetic core network under the control of MLL-ENL fusion protein. Lastly, we will explore the application of the EPZ004777, a potent small molecule DOT1L inhibitor, in selective killing the MLL-rearranged leukemic cells. More specifically, we plan to test the therapeutic effect of this small molecule on the DNMT3a-null leukemic cells. This proposal represents a significant advance toward the goal of personalized therapeutics for MLL patients.

DNA甲基化和组蛋白修饰是造血系统发育和白血病发病过程中的重要机制。在MLL白血病中，MLL肿瘤融合蛋白阻碍启动子DNA甲基化，参与促进Hoxa9的表达和组蛋白H3K79高甲基化。然而目前对MLL白血病全基因组水平上的表观遗传学研究还处于起始阶段。我们将在MLL融合蛋白的可诱导系统中，运用甲基化和转录组测序并结合功能实验验证，寻找DNA低甲基化参与激活的关键通路。我们还将选用组蛋白H3K79甲基化的阻滞剂EPZ004777,结合Dnmt3a突变的病人细胞模型，检验其对Dnmt3a缺陷基因型白血病细胞的治疗效果。基于H3K79过度甲基化在MLL白血病中的重要作用，利用这一小分子模型探讨DNA甲基化和组蛋白修饰在白血病发病中的相互协同作用。本研究运用细胞功能实验和高通量测序，在全基因组和关键调控通路两个水平上探讨DNA甲基化在MLL白血病发病中的作用机制，为白血病的治疗提供理论基础。

DNA甲基化是发生在哺乳动物基因组上最常见的一种共价修饰，且对包括正常细胞分化到疾病的发生发展等多种生物过程至关重要。DNA甲基化模式发生的改变及其导致的甲基化变异则使得具有相同遗传基础的细胞表现出不同的表型。DNA甲基化是造血系统发育和白血病发病过程中的重要机制。在混合型白血病（MLL，即髓系淋系混合白血病）中，MLL肿瘤融合蛋白阻碍启动子DNA甲基化，参与促进Hoxa9的表达和组蛋白H3K79高甲基化，我们利用小鼠来源的MLL-ENL 诱导型csh3细胞系来研究MLL融合蛋白的存在与否将引发基因组中大量位点的DNA甲基化的变化。Hoxa9和Meis1作为MLL-ENL诱导的细胞无限增殖的关键靶点，我们检测了Hoxa9及Meis1启动子区 CpG island 在+4-HT和-4-HT 72h两种状态下的甲基化状态，以期寻找MLL-ENL参与的关键性表观遗传调控模式。另外，我们利用一些研究较为广泛的生物系统，如胚胎干细胞及多能干细胞，致力于解析不同形式的甲基化变异。我们开发了DMEAS软件以分析DNA甲基化模式的分布并计算基因组segments的甲基化熵来量化甲基化模式的变异。接下来，我们将甲基化熵应用到解析混合细胞群体的甲基化异质性方面，并进一步定量评估了脂肪干细胞（ADS），ADS诱导分化的成熟脂肪细胞（ADS-adipose），以及ADS诱导的多能干细胞（ADS-iPSCs）的甲基化变异。其次，我们研制了全基因组水平发卡型亚硫酸盐测序技术（hpBSseq），可以同步生成同一个DNA分子的两条互补链的DNA甲基化数据，以计算甲基化保真度。接下来，我们将hpBSseq应用到处于未分化及分化状态的小鼠胚胎干细胞ES-E14TG2a细胞系，以获得在干细胞从自我更新状态转换到分化状态时的甲基化模式的变异。最后，我们尝试研究并理解不同甲基化变异形式，包括等位基因间特异DNA甲基化（ASM）及细胞子群间特异DNA甲基化（CSM）。我们利用小鼠基因组上已知的SNP信息开发并训练了一个具有机器学习技能的分类器进行预测SNP关联的ASM的统计模型，并利用逻辑回归分类器对人类大脑甲基化组进行群聚型序列依赖的ASM的预测。另外，我们开发了一套信息分析流程，利用单细胞甲基化组的数据从未分化的小鼠胚胎干细胞群体中提取细胞子群特异的甲基化，并整合了单细胞转录组数据来研究CSM的调控模式。