BMP-6调控MMP表达抑制乳腺癌细胞转移的功能和机理研究

BMP-6 (Bone morphogenetic protein 6) plays an important role in breast cancer growth, and members of the MMPs family also participated in multiple steps of tumorigenesis and development in breast cancer. However, the molecular mechanisms of these processes remains far less understood. Our recent research has implied that BMP-6 may suppress breast cancer metastasis. Furthermore, we found that, during this process, BMP-6 down-regulates the expression of MMP-1, 2, 9 and 14 at transcriptional level in MDA-MB-231 cells. BMP-6 remarkably down-regulates MMP-1 expression at both mRNA and protein levels. we hypothesize that BMP-6 exerts an inhibitory effect on breast cancer cell invasion through regulation of MMP-1 expression. To prove the hypothesis: ①Over-expression or knockout endogenous BMP-6 and MMP-1 to detect the migration and invasion of breast cancer cell; ；②Application luciferase activity analysis, reveals the effect of BMP-6 on MMP-1 promoter activity; ③Site-specific mutagenesis and CHIP technology are used to find relevant transcription factors on signal pathways; ④ Analysis of clinical breast cancer samples to demonstrate a significant correlation between BMP-6/MMP- 1 expression and breast cancer metastasis.The results of this study will broaden our knowledge on molecular mechanisms of BMP-6/MMP-1 in breast cancer invasion and metastasis, benefit the development of novel molecular targeted drugs for treatment of breast cancer.

BMP-6在乳腺癌发生发展中发挥着重要作用，且MMPs家族成员也参与了乳腺癌的多个环节，但作用机制尚未清楚。我们前期实验发现，BMP-6可抑制乳腺癌迁移和侵袭，且抑制了MMP-1、2、9和14等多个MMPs表达，尤其对MMP-1抑制最明显。我们推测，BMP-6可能是通过调控MMP-1的表达实现对乳腺癌细胞转移和侵袭的抑制作用。为了证实该假设，本课题拟①过表达或敲除内源性BMP-6、MMP-1，检测其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响；②应用荧光素酶活性分析，揭示BMP-6对MMP-1启动子活性的调控特点；③采用定点突变和ChIP技术，寻找到相关的转录因子和信号通路；④通过检测乳腺癌临床标本BMP-6/MMP-1表达，分析其与乳腺癌转移的相关性。本研究结果将进一步阐明BMP-6对MMP-1的调控关系，及其在乳腺癌细胞侵袭和转移中的作用及其机制，为开发新的分子靶向药物用以治疗乳腺癌症提供科学依据。

骨形态发生蛋白6（BMP-6）是一个多功能分子，在胚胎发育、器官发生，癌症发生过程中发挥着不同功能，且MMPs家族成员也参与了乳腺癌发生发展的多个环节。我们首先成功的构建了稳定过表达或特异性敲除内源性BMP-6的MDA-MB-231乳腺癌细胞株，并且Boyden chambe实验结果表明BMP-6能够显著的抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。Q-PCR实验结果表明BMP-6可以抑制MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-14的表达，同时促进TIMP-1和TIMP-2的表达，其中对MMP-1的下调最为明显。随后Boyden chamber实验结果显示过表达MMP-1能够显著的促进MDA-MB-231的侵袭，且可以部分恢复或削弱BMP-6对MDA-MB-231的侵袭能力的抑制；而敲低内源性MMP-1表达或用MMP-1抑制剂处理，效果则反之。双荧光素酶实验结果表明BMP-6可以显著的抑制不同截短长度MMP-1启动子的活性，且BMP-6对MMP-1启动子活性的抑制具有剂量和时间依赖性。在线工具TRANSFAC和TESS对人MMP-1 (-159/+19)启动子分析结果发现在-70/-69位置存在一个可能参与BMP-6调控MMP-1转录的潜在AP-1结合位点。荧光素酶实验表明TPA（AP-1信号通路激活剂）上调MMP-1启动子活性，而Curcumin（AP-1信号通路抑制剂）抑制MMP-1启动子活性。对该位点定点突变构建突变载体，荧光素酶实验表明表明该位点在BMP-6调控MMP-1转录过程中发挥重要功能。Q-CHIP实验结果表明c-Fos/c-Jun能够结合到内源性的MMP-1启动子上，并且BMP-6可以显著的抑制c-Fos/c-Jun结合到MMP-1启动子上。免疫组化染色结果表明BMP-6/MMP-1在乳腺癌、癌旁乳腺组织和正常淋巴结组织的表达存在明显差异；且BMP-6在乳腺癌中的阴性表达率是30.56%，在癌旁乳腺组织中阴性表达率是9.58%。BMP-6在部分乳腺癌中表达缺失可能是导致乳腺癌发生的一个诱因。综上所述，在乳腺癌细胞中，BMP-6通过下调MMP-1的表达，同时上调TIMP-1和TIMP-2的表达双重机制抑制MDA-MB-231细胞的转移。BMP-6对MMPs家族成员的表达调节方面的研究，为开发新的分子靶向药物和乳腺癌防治提供一些新的思路。