TIE1及相关因子在淋巴管特异性结构建立与维持中的作用机制研究

Lymphatic vessels have specialized structures due to the lymph absorption and draining function. Our previous studies have demonstrated that TIE1 play important roles in the formation and remodelling of primary lymphatic network. Deletion of Angpt2 also disrupted lymphatic development but with some distinct lymphatic phenotypes, suggesting a compensatory role from other ANGPT family members. It has been reported that mouse ANGPT4 has similar function to ANGPT2 in receptor binding and activation. In this study, we propose to employ conditional knockout mouse models targeting Tie1, Angpt4 and Angpt2. By crossing the floxed mouse lines with transgenic mice overexpressing CreERT2 in lymphatic endothelial cells, we will generate cell-specific knockout mouse models for examining the roles of ANGPT4 and the potential synergistic role with ANGPT2 in the formation and maturation of lymphatic endothelial cell-cell (LEC) junctions during development. Using isolated primary lymphatic endothelial cells from wild-type and genetically modified mouse models, we will analyse the alteration of cell junction related gene expression and downstream pathways after induced deletion of Angpt2/4 and Tie1, and also the effect of fluid shear stress on LEC junction formation. We will investigate lymphatic growth and LEC-junction formation in wound healing of adult mice when ANGPT-TIE1 mediated signals are absent or reduced. We will also analyse the change of LEC junction in lymphedema mouse models and explore therapeutic methods to restore the abnormal lymphatic structure. Findings from this study will provide further insights into the mechanism underlying the formation and maturation of specialized lymphatic structures, and also lymphedema related pathology.

淋巴液吸收与回流功能决定了淋巴管特殊的结构。本课题组前期研究发现，血管生成素ANGPT2虽不直接结合TIE1,但其缺失导致与Tie1基因敲除类似但不完全一致的淋巴管发育缺陷。鼠源ANGPT4与ANGPT2有类似受体激活特性，可能存在功能互补。本项目制备了靶向Angpt4的条件性基因敲除小鼠模型，结合细胞特异表达CreERT2重组酶的转基因小鼠，研究Angpt4缺失或Angpt2/4双基因敲除对淋巴管生成的影响；剖析Tie1 与Angpt2/4诱导敲除后细胞连接相关基因表达及下游信号的变化；利用原代淋巴管内皮细胞，研究上述因子缺失对响应液体剪切力的变化与内皮细胞连接建立的影响；比较分析成年小鼠组织修复过程中TIE1与血管生成素对淋巴管生成的作用；并结合疾病动物模型，探索淋巴水肿病理情况下内皮细胞连接的变化及修复方法。研究结果将为阐明淋巴管成熟重塑的调控机制及相关疾病的治疗提供重要依据。

淋巴管生长与成熟重塑受多种因子的协同调控，本课题组前期研究发现，血管生成素ANGPT2虽不直接结合TIE1,但其缺失导致与Tie1基因敲除类似且有差异的淋巴管发育缺陷；鼠源ANGPT4与ANGPT2有类似受体激活特性，可能存在功能互补。为探索血管生成素（ANGPTs）与受体酪氨酸激酶TIE1在淋巴管网络构建与稳态维持中的作用机制，本项目制备了靶向血管生成素Angpt4的条件性基因敲除模型，利用该基因敲除小鼠开展的研究发现，ANGPT4缺失导致视网络静脉发育异常，但对淋巴管生成、瓣膜发育与淋巴管网络成熟重塑没有明显影响；出生后利用他莫西芬诱导敲除血管生成素Angpt2后前集合淋巴管瓣膜的数量明显减少,该表型与在新生鼠诱导敲除Tie1基因的表型类似，即其集合淋巴管瓣膜发育受阻。为进一步研究TIE1与ANGPT2是否在同一信号途径，本项目制备了靶向双基因的杂合敲除小鼠模型，表型分析表明Angpt2+/-;Tie1+/-双基因杂合敲除对淋巴管网络的生成与重塑没有明显影响。针对ANGPT2的进一步研究发现，ANGPT2缺失导致淋巴管内皮细胞表达的淋巴管生长关键因子VEGFR3显著下降。因此本项目结合全身性及淋巴管内皮细胞表达CreERT2重组酶的转基因小鼠, 制备全身性诱导敲除VEGFR3配体结合区的（Vegfr3lbd）的遗传改造小鼠模型（Vegfr3lbdFlox/-;Ubc-CreERT2）、以及淋巴管特异性敲除Vegfr3lbd的小鼠模型（Vegfr3lbdFlox/-; Prox1-CreERT2），研究VEGFR3介导的信号变化在淋巴管成熟重塑中的作用机制，研究发现VEGFR3信号降低导致新生鼠与成年小鼠生长受抑制，并导致淋巴管细胞连接异常等病理变化；利用RNA-Seq分析淋巴管内皮细胞诱导上述基因敲除后表达谱的变化、与相关机制研究仍在进行中。另外，哺乳动物的淋巴管主要源于静脉，本项目执行过程中发现卵泡抑素样因子FSTL1参与调控静脉与心脏瓣膜稳态维持，利用在内皮细胞特异性敲除Fstl1的小鼠模型开展的研究发现，其缺失对淋巴管网络的生成、瓣膜发生与稳态维持没有明显影响。淋巴管参与许多重大疾病的发生与发展过程，本项目的研究结果为淋巴管相关病变的临床研究以及开发新的治疗方法提供了实验依据，具有重要的科学意义与应用价值。