H2O2致人毛囊无色素性黑素细胞线粒体氧化损伤机制及补肝益肾中药的保护作用

白癜风肝肾不足证局部特征性白毛症候与西医白斑毛囊口复色均基于毛囊中无色素性黑素细胞（AMMC）功能正常与否。复习中外文献提示毛囊复色治愈白斑的2个必要前提是：AMMC移行力的激活及其免受H2O2氧化损伤。本课题在前国家自然科学基金"外毛根鞘AMMC激活与移行的研究 "(30170826)基础上，拟① 研究H2O2对AMMC移行能力的损伤及滋补肝肾中药的干预作用。②观察补肝益肾药加入经H2O2预处理AMMC前后其移行力及线粒体通透性转换孔开放程度、超微结构、跨膜电位及细胞凋亡等功能变化。③以线粒体基因表达谱芯片测定补肝益肾药干预氧化损伤AMMC前后其线粒体DNA差异表达基因谱。印证H2O2通过损伤线粒体功能及影响AMMC线粒体特定基因表达谱而阻抑毛囊AMMC迁移力，何首乌等补肝益肾药对上述病理过程有保护性作用。适时以此中药保护AMMC线粒体免受自由基损伤，将大幅提升白癜风经毛囊复色治愈率。

白癜风易诊难疗,文献提示白斑处在以高浓度 H2O2 为特点的氧化应激状态，复习文献，我们认为其复色的2个必要前提是：黑素细胞移行力的激活及其免受 H2O2氧化损伤。因此，先进行了H2O2对人黑素细胞迁移影响的实验，transwell结果显示H2O2能明显抑制细胞的迁移。同时采用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行了染色，结果显示H2O2作用下细胞树突缩短，应力纤维消失。.细胞内的H2O2主要来源于线粒体，同时线粒体也是H2O2攻击的对象。线粒体的基本功能是通过氧化磷酸化以ATP的形式为细胞提供能量，对维持细胞的能量代谢和生命活动起重要作用。为明确H2O2所致的迁移阻抑是否与线粒体功能障碍有关，进行了氧化应激状态下线粒体功能的相关实验。结果显示，电镜下H2O2使得线粒体基质电子密度降低, 嵴模糊不清甚至消失，可见空泡形成。以 JC-1 荧光探针通过流式细胞仪检测线粒体膜电位,显示H2O2显著诱导线粒体膜电位下降。采用荧光素酶法检测细胞内 ATP 含量,结果发现H2O2降低了ATP 水平。同时采用了表达谱芯片对H2O2诱导的细胞线粒体功能障碍相关信号通路进行了筛选和验证。结果显示H2O2下调线粒体氧化磷酸化过程中COX1、COX2、ND2相关基因的表达。.我们选择了高频使用补益肝肾药制何首乌、墨旱莲和熟地进行了实验。首先我们进行了三种中药水提物对黑素细胞生物学特性的筛选。结果显示墨旱莲对细胞生长无促进作用，促进细胞内酪氨酸酶活性及黑素合成，促进细胞迁移及mitf 的表达。何首乌促进细胞增长，对酶活性及黑素合成无影响，促进细胞迁移及mitf 的表达。熟地黄促进细胞增长，对酶活性无影响，促进黑素合成、细胞迁移及mitf 的表达。我们继续选取墨旱莲进行了氧化应激下的相关实验。结果显示墨旱莲预处理后，对H2O2作用下的黑素细胞移行障碍有保护作用，能明显改善细胞树突缩短及应力纤维消失等细胞骨架异常现象。能显著改善线粒体膜电位的下降、ATP合成的降低。同时对COX1、COX2、ND2下调表达有改善作用。.综上所述，我们推断H2O2极有可能是通过下调COX1、COX3、ND2的表达，引起线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍，引发ATP合成降低而抑制黑素细胞移行。补肝益肾中药墨旱莲则可能通过上调上述基因的表达，部分恢复线粒体呼吸链氧化磷酸化功能，上调ATP合成而改善H2O2对细胞迁移的阻抑作用