DEAH/RHA类RNA解旋酶AtRH59调控拟南芥雌配子体发育的分子机理研究

配子体的发育是被子植物世代交替过程中的关键环节，研究表明mRNA剪接调控拟南芥雌配子体的发育。我们分离到一个拟南芥雌配子体发育的突变体，命名为atrh59。序列分析表明AtRH59编码RNA解旋酶，酵母中的同源蛋白参与pre-mRNA剪接。AtRH59除含有RNA解旋酶保守的DEXDc和HELICc结构域以外，还含有HA2和DUF1605两个结构域，属于植物中一类新的未知功能的RNA解旋酶(DEAH/RHA类)。拟南芥基因组中有24个基因编码DEAH/RHA类RNA解旋酶，但是这类RNA解旋酶在植物发育过程中的功能还不清楚。本研究通过基因表达模式分析、解旋酶活性分析、酵母突变体互补、蛋白质互作、Tiling array分析以及蛋白质与mRNA互作等方面来研究AtRH59通过参与pre-mRNA剪接调控拟南芥雌配子体发育的分子机制，了解DEAH/RHA类RNA解旋酶在植物发育过程中的功能。

被子植物的雌配子体又称为胚囊。雌配子体的形成过程，不仅是被子植物世代交替的关键阶段，也是种子和果实产生、粮食产量形成的基础。RNA的合成和加工过程也参与了雌配子体发生的调控。RNA 解旋酶在RNA转录、翻译、RNA加工以及核糖体装配等RNA代谢过程中发挥重要作用。拟南芥基因组中包含100多个RNA 解旋酶，但是只有少数基因的功能得到验证。本课题是在鉴定到一个拟南芥DEAH/RHA 类 RNA 解旋酶基因AtRH59/AtDEAHb3的突变体的基础上展开的。. AtDEAHb3基因在拟南芥分生组织、叶片、幼嫩花粉和胚珠发育过程中表达。AtDEAHb3蛋白分布在细胞质、细胞核中。AtDEAHb3解旋酶含有四个保守的结构域 DEAH、HELICc、HA2和OB-fold。拟南芥AtDEAHb3 T-DNA插入突变体雌配子体发育过程中的有丝分裂进程延迟，雌配子体发育的同步性被破坏。这些延迟发育的雌配子体不能参与受精，导致种子败育。延迟授粉实验发现通过雌配子的传递效率上升，表明部分突变的雌配子体最终可以发育成熟并能受精。这些结果表明AtDEAHb3在拟南芥雌配子体的发育中起重要作用。. 拟南芥的AtDEAHb3能够互补酵母prp22突变体的热敏感表型，推测拟南芥的AtDEAHb3参与了物中mRNA前体的剪接。拟南芥GFA1在酵母中的同源蛋白Snu114p是剪接复合体U5 snRNP的主要组份。酵母双杂交实验、BIFC实验和Pull-down实验证实AtDEAHb3可以和GFA1相互作用。进一步通过AtDEAHb3的不同片段分别与GFA1进行酵母双杂交分析，发现AtDEAHb3通过其DEAH和HELICc domain之间的序列与GFA1相互作用。通过氨基酸位点的突变以及突变体表型互补分析，我们鉴定到AtDEAHb3的266、267位的氨基酸在AtDEAHb3的与GFA1的互作中起关键作用。进一步我们鉴定了多个基因的pre-mRNA的剪接受到AtDEAHb3和GFA1的调控，这些基因在胚囊发育过程中起作用。. 我们的研究表明AtRH59/AtDEAHb3可能通过与拟南芥中U5 snRNP复合体的互作，参与调节胚囊发育进程重要功能基因的前体mRNA的剪接。研究结果为有助于进一步理解pre-mRNA剪接在调控拟南芥雌配子体发育过程中作用的分子机理。