建立直接竞争无毒ELISA体系检测食用植物油中苯并芘的方法学研究

苯并芘是强致癌物之一,其污染的食品，有公认的致畸、致癌的慢性毒性。操作人员在采用国标法、仪器检测法或传统ELISA分析方法检测苯并芘时，存在长期接触有毒标准品的潜在危害，且其废弃物对环境有二次污染的隐患。本课题拟通过合成含羧基功能团的BaP衍生物，制备BaP免疫抗原，研制抗-BaP的特异性单克隆抗体；以此抗体淘选丝状噬菌体M13外壳蛋白pⅢ上的随机七肽库，获得多组BaP模拟抗原表位多肽序列；合成生物素标记多组模拟抗原表位的多肽，采用计算机模拟、抗原活性测定以及圆二色谱等手段，探讨有关多肽模拟表位的构型变化与无毒ELISA检测方法学稳定性之间关系，并进一步建立BaP的无毒ELISA检测方法，为探索剧毒类小分子化合物无毒ELISA检测方法学的建立奠定理论基础。

苯并芘是强致癌物之一，其污染的食品，有公认的致畸、致癌的慢性毒性。操作人员在采用国标法、仪器检测法或传统ELISA分析方法检测苯并芘时，存在长期接触有毒标准品的潜在危害，且其废弃物对环境有二次污染的隐患。因此，本课题组建立无毒ELISA体系检测苯并芘。本课题通过碘代、Heck偶联两步化学反应合成苯并芘的羰基衍生物，经肟化反应将其羧基化，再采用活化酯法将羧基化半抗原与载体蛋白偶联，获得偶联比为28:1的全抗原。本试验采用红外光谱(IR)、核磁共振波谱 (1H NMR和13C NMR) 、质谱(MS)对苯并芘中间产物进行了表征，并用紫外扫描的方法对人工抗原进行了鉴定。以此全抗原免疫 BALB/C 小鼠，采用甲基纤维素半固体培养基法筛选抗苯并芘的特异性单克隆抗体，其效价为1.76×105；间接竞争ELISA方法测定抗体抑制率，半量抑制浓度(IC50)约为13.74ng/mL；在5ng/mL-50 ng/mL范围内线性相关；与苯并芘结构类似物有一定程度的交叉反应；同时检测了南昌市周边的5个水源，发现均没有污染苯并芘及其结构类似物。以此抗体淘选重链单域抗体库中的苯并芘模拟表位肽，获得6种多肽；通过phage ELISA评价，其中一种多肽较好；将其人工合成并在其C端标记生物素，通过棋盘滴定法确定抗体和苯并芘模拟肽的最佳用量；再通过直接竞争ELISA，绘制模拟肽的ELISA抑制曲线，结果显示IC50为22.53ng/mL，最低检测限为5ng/mL，线性范围为5ng/mL-50ng/mL，批内加标回收率为84.63-116.41%，批间加标回收率为97.27%～123.13%；其加标检测结果与GC-MS的检测结果基本一致, 表明无毒ELISA检测体系构建成功。实际样品采样检测，反映目前市场中的食用油，包括大豆油、菜籽油和玉米油等，苯并芘未超标。