杀线虫坚强芽胞杆菌Ds-1的关键活性成份鉴定及其功能研究

Plant parasitic nematodes (PPNs) cause serious harm to the agricultural production. Bacillus firmus showed excellent control effect on PPNs and has potential for developing as commercial nematocidal formulation. However, its nematocidal factors and functions are not clear yet, Which also prevent the pesticide registration to be approved. To solve the problem, the main virulent factors and their function should be clarify. Based on our completed genome sequence, previous work showed that a novel important virulent factor, Sep1, can act as serine protease and degrade multiple intestinal-associated nematode proteins, which then induced the host innate immune response effectors Reactive oxygen species (ROS) to defense the infection bacteria, whereas its not the only one active factor in the infection process of Bacillus firmus. As a potent nematicide, Bacillus firmus also can product other factors, Our project proposal aimed to systematically elucidate all the main active compounds, proteins and nonproteinous function in Bacillus firmus nematode killing process via analysis of its function role in the Bacillus firmus biofilm formation and soil microbiota in rhizosphere, and function in reducing the innate immunity signaling in vivo, and targeting the physical system and intestinal epithelium. What bring to the knowledge of active compouds’ function on pathogenesis of nematode, also help us to identify more high virulent Bf strains and give more basis research results on nematicidal mechanism of B. firmus further. Based on our research, we could developed a novel durable efficient bionematicide.

植物寄生线虫在农业上的危害巨大，但抗线虫细菌性农药资源匮乏，本室分离的坚强芽胞杆菌（Bf）Ds-1因其具有对植物寄生线虫高毒力而有望被开发成国内商业化的杀线虫剂，但因其有效成份及毒理功能未知成为农药登记及后续深入研究机制上的瓶颈，解决问题需要明确Bf杀线虫的有效组份及作用方式。前期工作完成了Bf基因组测序并预测了大量活性物质，前期实验发现作为蛋白酶的Sep1和作为次级代谢产物的C30对线虫有明显灭杀作用。本项目试图通过基因组预测及反向遗传学手段，系统性发掘其它对线虫具有灭杀活性的Bf蛋白类和次级代谢产物，并进一步研究这些活性物质（包括Sep1和C30）在根际形成生物膜上及根际微生物群落改变上的影响，在线虫生理组织上病理形成的影响和天然免疫响应上的影响，以此来阐述各组份在杀虫过程中的功能及作用方式。为深入研究揭示Bf杀线虫机制及开发高效杀线虫剂提供理论基础。

植物寄生线虫造成的损失巨大，而市场上有效防治的农药为化学高毒农药，生物农药资源非常匮乏。坚强芽胞杆菌已开发成微生物杀虫剂，但有效成分及作用机制未知，本项目旨在探寻活性成分，在完成坚强芽胞杆菌基因组测序后发现并初步证明含多种杀线虫相关的毒力因子并克隆到2个蛋白；证明了其中Sep1南方根结线虫和腐烂茎线虫具有一定的毒性；通过荧光观察，证明了Sep1能够破坏C. elegans的肠道组织；其靶标可能是卵黄原蛋白和肌动蛋白(act-3)；获得了Sep1处理C. elegans的蛋白质组数据，通过荧光定量PCR进行了验证，数据和组学数据吻合，并推导了其杀线虫模型；同时发掘了坚强芽胞杆菌中的主要次级代谢产物C30和其他小分子化合物的多样性，证明了其一毒力因子反式乌头酸，并发现基因组存在生物合成的PrpF家族乌头酸异构酶，通过在土曲霉菌株中成功构建细胞工厂并开发20吨发酵及分离工艺产量达20g/L，初步完成一代原药产品纯度达85%；.坚强芽胞杆菌作为微生物菌剂，其有效成分反式乌头酸作为新型生物源化学农药的创制都是植物寄生线虫防治的重要组成，而目前对环境友好的生物农药，仅有阿维菌素类产品长时间单一产品的施用已经造成抗性线虫出现和使用剂量的成倍增加，不同靶标及作用机制的产品开发为杀线虫制剂的选择提供了有市场竞争力的替代品，并且为抗性线虫的防治提供了可供选择的产品。开发的新型杀线虫产品主要有效成分反式乌头酸通过一类新药申请将成为线虫防治领域的市场高地。因反式乌头酸折算成本约为5万元/吨，与阿维菌素（50万元/吨）和化药噻唑膦（45万元/吨）相比具有很强的市场竞争力，本项目两种制剂的推荐势必进一步降低农民的用药成本，同时降低化学法生产农药造成的环境污染治理成本，继续贡献于农药化肥的“两减一增”计划深入实施。