KLHL22-CUL3-RBX1通过泛素化GSDMD负调控脓毒症性肝损伤

Sepsis is a serious disease with multiple organ dysfunction due to host immune response to infection. It is one of the main causes of death in ICU patients. Sepsis can often lead to liver injury and even liver failure, and the degree of liver injury is directly related to adverse prognosis. Liver injury caused by sepsis has attracted much attention, but the mechanism is unknown. Our preliminary experiment indicated that LPS induced the pyroptosis of hepatocyte due to cleavage of GSDMD to release N-GSDMD. The genes associated with LPS-caspase4/11-GSDMD cascade were highly expressed in liver tissues and hepatocytes. Mass spectrum assay identified the co-immunoprecipitation of KLHL22 with GSDMD. The subunits of KLHL22-CUL3-RBX1 ubiquitin ligase E3 were also highly expressed in hepatocytes. Therefore, we speculate that during sepsis, LPS-caspase4/11-GSDMD cascade release of N-GSDMD leads to hepatic pyogenic death. In this study, we analyzed the degradation of KLHL22-CUL3-RBX1 ubiquitin GSDMD to inhibit liver injury at animal, cell and molecular levels. The aim of this study was to reveal the GSDMD ubiquitin modification and its protective mechanism in sepsis-induced liver injury, and to provide a new target for the treatment of sepsis.

脓毒症是由于宿主对感染的免疫反应失调，而导致多器官功能障碍的严重疾病。其是目前ICU病人死亡的主要原因之一。脓毒症常可引起肝损伤甚至肝衰竭，且肝脏损伤程度与不良预后直接相关。由脓毒症引起的肝损伤已引起高度重视，但目前机制不明。我们的预实验结果表明LPS可通过诱导N-GSDMD释放，导致肝细胞焦亡。同时，LPS-caspase4/11-GSDMD级联相关基因在肝细胞高表达。质谱分析显示KLHL22与GSDMD共沉淀，KLHL22-CUL3-RBX1泛素化酶E3的亚基亦高表达于肝细胞。因此我们推测：在脓毒症发生过程中，LPS-caspase4/11-GSDMD级联释放N-GSDMD致肝细胞焦亡。本实验将从动物、细胞及分子水平，分析KLHL22-CUL3-RBX1泛素化GSDMD致其降解从而抑制肝损伤。本研究旨在揭示GSDMD泛素化修饰及其在脓毒症性肝损伤中保护机制，为脓毒症治疗提供新靶点。

脓毒症是一种全身性炎症反应，严重时可引起器官功能障碍和循环系统疾病。 当炎症反应失调时，可能会出现严重的并发症，包括脓毒症引起的肝损伤等。 多种 microRNA 以及环状 (circ) RNA 参与炎症反应； 然而，它们在调节脓毒症引起的肝损伤中的具体作用机制仍然尚不明确。 盲肠结扎和穿刺 (CLP) 法可诱发脓毒症相关肝损伤以及多种微生物导致的脓毒性。 在这项研究中，应用CLP 方法建立动物模型，诱导脓毒症相关肝损伤模型， 然后，评估肝功能损伤程度、炎性细胞因子表达水平和肝组织病理学损伤情况。 采用高通量测序发现CLP后肝脏circRNA表达异常。 同时，在体外，利用Raw264.7细胞模拟LPS诱导的体外脓毒症炎症模型。 通过定量聚合酶链反应 (PCR) 和酶联免疫吸附试验研究 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 和蛋白质水平变化。 使用双荧光素酶报告基因检测探索了 circRNA、miR-31-5p 和 Gasdermin D (GSDMD) 之间的功能联系。实验还应用 Western blot 方法测试 GSDMD、caspase-1 和 NLRP3 在小鼠和细胞模型中的表达。 实验结果表明，CLP 诱导的脓毒症通过增加炎症性细胞焦亡促进肝损伤。 circ-Katnal1的异常表达在CLP诱导的脓毒症中起重要作用，下调 circ-Katnal1 可抑制 LPS 诱导的 Raw264.7 细胞炎症性焦亡。 生物信息学和荧光素酶报告结果证实 miR-31-5p 和 GSDMD 是 circ-Katnal1 的下游靶标，抑制 miR-31-5p 或上调 GSDMD 可逆转沉默 circ-Katnal1 的保护作用。 最终得到的结论，circ-Katnal1 通过 miR-31-5p/GSDMD 轴增强脓毒症相关肝损伤中的炎症性焦亡。