好氧甲烷氧化完全反硝化微生物及其代谢过程研究

Generally speaking, aerobic methane oxidation coupled to denitrification (AME-D) process is performed by the cooperation of aerobic methanotroph and denitrifier. However, it is recently discovered that aerobic methanotroph can perform AME-D process without the collaboration of denitrifier. Unfortunately, the denitrification process carried out by aerobic methanotroph is not complete, releasing nitrous oxide (its greenhouse effect is almost 298 times higher than methane) as the terminal product. Doesn’t the pathway of aerobic methane oxidation coupled to complete denitrification (AME-CD) exist in single strain of aerobic methanotroph in natural habitats under low dissolved oxygen? On the basis of thermodynamic analysis and functional genes of denitrification, we predicted that AME-CD process should exist in aerobic methanotroph. Nevertheless, up to now, there has been no direct evidence. In this project, we plan to isolate single strain of aerobic methanotroph with the function of AME-CD process from aerobic methane oxidation enrichments with suspected denitrifying functions. Modern technologies of chromatography analysis and stable isotope tracer technique will be adopted to clarify denitrifying characteristics of the isolates and to confirm the process of AME-CD. Genomics, biological thermodynamics and stoichiometry will be used to unravel the potential mechanism of AME-CD process. Results of the study will be of great significance in providing theoretical supports for the treatment of NOx--contained eutrophication water and in developing novel biotechnologies for nitrogen removal from wastewater.

一般认为好氧甲烷氧化反硝化过程（AME-D）由好氧甲烷氧化菌和反硝化菌协作完成。近年来研究发现，好氧甲烷氧化菌可以在氧化甲烷的同时不需要反硝化菌的协作便可独立进行不完全反硝化过程，产生温室效应更强的N2O气体。那么自然界中难道就不存在不产生温室气体N2O而形成N2的好氧甲烷氧化菌完全反硝化代谢过程（AME-CD）？然而，借助功能基因和化学热力学分析我们推测，在低氧条件下好氧甲烷氧化菌完全可以独立实现AME-CD。但是缺乏直接的实验证据。本项目拟借助中空纤维膜反应器对前期获得的AME-CD疑似培养物和浅层水体底泥样品进行微生物定向富集，并从中分离筛选高效好氧甲烷氧化反硝化菌；应用现代色谱分析技术与同位素示踪技术证实AME-CD过程；借助微生物基因组学、代谢组学、化学热力学和化学计量学分析手段揭示AME-CD过程这一新型生物地球化学途径机理，为地表含氮富营养化水体治理技术的研发提供依据。

好氧甲烷氧化耦合完全反硝化（AME-CD）可将CH4用于反硝化过程而不产生N2O，是一种适用于低碳氮比废水深度脱氮的新型水处理技术。针对好氧甲烷氧化完全反硝化过程，成功设计并搭建了AME-CD中空纤维膜反应器（MBfR），并在此基础上获得了2株I型好氧甲烷氧化菌。后续,选择利用宏基因组学的手段对AME-CD过程的代谢途径进行解析，共获得52个参与AME-CD过程的微生物的基因组。在此基础上，借助化学计量学与热力学方法对AME-CD过程进行了研究。结果显示，甲醇和甲醛是AME-CD过程较为适合的甲烷衍生碳，其用于AME-CD过程的理论最小C/N值分别为1.39和1.51 mol-CH4 mol-1-NO3-。然而，但它们仅可被某些特定的反硝化菌（如Methylophilaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodanobacteraceae和Hyphomicrobiaceae）利用。体系中的好氧甲烷氧化菌还可通过发酵代谢途径来生成更为有效的反硝化碳源，这些发酵代谢产物（甲酸、乙酸、琥珀酸和乙醇）用于AME-CD过程时的最小C/N值仅为1.25 mol-CH4 mol-1-NO3-。在厘清AME-CD过程的代谢途径后，还研究了氧气对AME-CD过程的代谢途径及微生物群落的影响。结果显示，不同O2:CH4条件下AME-CD过程的甲烷衍生碳代谢中间产物差异显著。借助基于LC-MS/MS技术的代谢组学方法，在正离子模式和负离子模式下分别鉴定出31种和20种差异代谢产物，多与脂肪、氨基酸代谢相关。不同O2:CH4下AME-CD过程甲烷衍生碳的变化也造成了AME-CD微生物群落选择模式差异。高O2:CH4下AME-CD微生物群落的构建过程以一致性选择为主，低O2:CH4下则以多样性选择为主。课题相关的研究成果在Water Research和Science of The Total Environment等国际知名学术期刊发表研究论文2篇，投稿SCI论文2篇；培养博士研究生2名，硕士研究生1名。按计划较好地完成了项目设置的各项考核指标。研究结果丰富了AME-CD过程这一潜在的碳氮元素生物地球化学循环新途径的认识，并对AME-CD工程微生物组的构建及反应器优化具有重要指导意义。